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1、优化样品前处理实现草本茶中农药残留 的LC/MS/MS 分析作者Derick Lucas安捷伦科技有限公司应用简报食品检测和农业前言草本茶已深深融入到多种文化中，通常被认为能够改善身体健康状况，降低各种疾病的发生，例如癌症、中风和骨质疏松症等1,2。对茶的高需求量，要求实施现代化的农业生产方式，包括施用农药来维持茶收成的稳定。无论是允许还是禁止使用的农药，其最大残留限量越来越低，因此对草药制品中颇多种类农药的检测就需要快速、稳定且高效的方法3。该方法中至关重要的一步就是样品前处理，尤其针对植物性基质，它们往往非常复杂，且包含有干扰的基质化合物，导致离子抑制、共流出和仪器污染。本研究采用快速、简
2、便、经济、高效、耐用且安全的称之为QuEChERS 的技术完成草本红茶和绿茶样品的前处理。QuEChERS 包括如下三个简便的步骤：1) 采用有机溶剂和分配剂盐进行萃取；2) 采用吸附材料（分散吸附剂）进行样品净化；3) 液相色谱或气相色谱分析，或两者均采用4,5。分散净化吸附剂包括C18、N-丙基乙二胺(PSA) 和石墨化碳黑(GCB)。对于包含大量色素的茶样品，GCB的使用越来越重要；但必须谨慎使用，因为它也会移除目标分析物，尤其是具有平面结构的化合物。采用Agilent Bond Elut QuEChERS 预称量的试剂盒优化QuEChERS 方法，实现快速简便的方法开发。该方法可以充分
3、净化高度着色的样品，大多数农药的回收率高，重现性好，平面结构农药没有明显的保留损失。2材料与方法HPLC 级乙腈购自Honeywell International, Inc.。反渗透水采用Millipore 水纯化系统制备。甲酸(98%) 为ACS 级，购自Sigma-Aldrich 公司。茶样品来自多家供应商，由合作者友情提供。标样来自Accustandards 公司，为浓度100 g/mL 的乙腈溶液。将它们混合并用乙腈稀释到适当浓度，储存在冷冻箱(3 C) 内。样品前处理萃取：适用于10 g 样品的Agilent Bond Elut QuEChERS Original萃取管（部件号598
4、2-5550）分散SPE 净化：Agilent Bond Elut QuEChERS 分散通用试剂盒，15 mL 分散SPE 管（400 mg PSA，400 mg C18，45 mg GCB，1200 mg MgSO4） （部件号5982-0029）过滤：Captiva Premium 注射式过滤器，尼龙膜，15 mm，0.2m（部件号5190-5088）QuEChERS 萃取称取干茶叶1 0.01 g，置50 mL 离心管中，按照要求给样品加标。于离心管中加水10 mL，加盖并涡旋1 min。样品彻底润湿后，将浓度50 ng/mL的内标（乐果-d6、敌草隆-d6和二嗪农-d10）乙腈溶液(
5、10 mL) 加入离心管中，加盖，手动振摇1 min，然后置超声水浴中超声15 min。取出离心管，加入Bond Elut QuEChERSOriginal 萃取盐（4 g MgSO4，1 g NaCl） ，然后将离心管手动强力振摇1 min。随后将样品以4000 rpm 的转速离心5 min，实现水相和有机相溶剂的分离（图1，步骤1） 。分散固相萃取离心后，将6 mL 上层乙腈溶液转移到Bond Elut QuEChERS 分散通用试剂盒的15 mL离心管中。将离心管涡旋1 min，然后以4000 rpm 的转速离心3 min。离心后，取2 mL 净化的萃取液加入10 mL 试管中，氮气流吹
6、至近干。采用0.7 mL H2O + 0.1% 甲酸(FA) 混合溶剂、0.2 mL 乙腈，以及0.1 mL 乙腈或校准标准液复溶样品。接着，将样品注射式过滤至自动进样器样品瓶中，用于LC/MS/MS 分析（图1，步骤2） 。步骤1 QuEChERS 萃取称取1.00 0.01 g 样品，置50 mL 离心管中必要时加标，加入10 mL H2O，加盖，振摇1 min加入10 mL 含有内标的乙腈溶液加盖，振摇1 min，超声15 min加入Bond Elut QuEChERS Original (10 g) 萃取盐， 振摇1 min步骤2 分散SPE 净化将6 mL 上清液转移至15 mL B
7、ond Elut QuEChERS 分散通用SPE 管中涡旋混合1 min 后，以4000 rpm 的转速离心3 min将2 mL 上清液转移到一个洁净试管中，氮气吹干用0.7 mL H2O + 0.1% FA、0.2 mL ACN， 以及0.1 mL ACN 或校准标准液复溶采用Captiva Premium 注射式过滤器过滤， 滤液置自动进样器样品瓶中，采用LC/MS/MS 进行分析图1. 绿茶和红茶萃取及净化的QuEChERS 工作流程以4000 rpm 的转速离心5 min3图2. 本研究分析的红茶加标浓度100 ppb 的176 种农药的叠加MRM 色谱图表1为化合物分析的MS/MS
8、参数，图2是所有加标浓度100ppb农药的MRM 叠加色谱图。校准曲线和线性通过混合安瓿中的认证标准液来制备储备标准液。将储备标准液用乙腈适当稀释来制备工作标准液。溶剂复溶时，将适量的工作标准液加入经QuEChERS萃取的空白绿茶和红茶样品中，制备基质匹配的标样，浓度分别为0.5、1、5、10、20、50、100和200 ng/mL。将三种内标加入所有样品，浓度50 ng/mL，并采用完整QuEChERS 工作流程进行萃取。通过这些标样得到线性校准曲线，R2不小于0.992（数据未显示） 。液相色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18， 2.1
9、150 mm，1.8 m（部件号959759-902）洗脱液：A：水+ 0.1% 甲酸 B：乙腈+ 0.1% 甲酸进样量：10 L流速：0.2 mL/min梯度程序：时间(min)% B 0.05 0.55 5.060 7.080 1295 1595柱温：22 C仪器：Agilent 1290 Infinity 液相色谱仪， Agilent 6410 三重四极杆液质联用系统质谱离子源参数模式：ESI+干燥气温度：300 C干燥气流速：7 L/min雾化器压力：35 psi毛细管电压：3500 V1.21061.110.90.80.70.60.50.40.30.20.101234567 ? (m
10、in)?8910111213144结果与讨论QuEChERS 萃取盐和净化试剂盒的选择为了实现最高的回收率和重现性，本研究评价了几种萃取盐试剂盒。在测试了Bond Elut QuEChERS Original、AOAC 2007.01 和EN 15662 萃取盐后，我们发现包含1 g NaCl 和4 g MgSO4的原萃取试剂盒可获得总体上最高的回收率。由于大量色素会与目标分析物一同萃取出来，因此，选择包含GCB 的分散净化试剂盒是非常必要的。我们发现，使用包含PSA、C18、GCB和MgSO4的Bond Elut QuEChERS 通用试剂盒，可以获得明显更洁净的样品，以及更高的回收率，并且
11、仅极小到中等程度地保留平面结构农药（多菌灵、噻菌灵、三环唑和嘧霉胺） 。回收率与重现性对于绿茶和红茶基质中的176 种农药，绝大多数使用本方法均可获得优异的回收率和重现性。对于绿茶样品，浓度10 ppb 82% 农药的回收率和浓度100 ppb 92%农药的回收率，均在70 - 120%范围内。对于红茶样品，浓度10 ppb 76%农药的回收率和浓度100ppb 88% 农药的回收率均在70 - 120% 范围内。如图3 所示，还有较少农药的回收率低于50% 并且有一些农药未能检出。表2列出了全部农药以及各自的回收率和相对标准偏差。图3. 176 种农药的回收率范围01020304050607
12、080901001100-1010-3030-5050-7070-9090-100100-120120ND? (%)? 10 ppb ? 10 ppb ? 100 ppb ? 100 ppb ?5表1. 本研究中使用的化合物列表及其各自的MS/MS 分析参数化合物母离子MRM 1碰撞能量1 (V)MRM 2碰撞能量2 (V)碎裂电压(V)保留时间(min)霜霉威189.2144.110102.1151202.128灭害威209.1152.110137.1201202.145吡蚜酮218.1105.02079.0201102.148高灭磷184.0143.0595.020902.154甲胺磷14
13、2.0125.01094.015803.902氧化乐果214.0183.05125.020804.495涕灭威亚砜207.1132.1589.05804.662多菌灵192.1160.120132.125904.753噻菌灵202.0175.030131.1401204.889麦穗宁185.1157.125156.0301205.02自克威223.0166.010151.0201105.023烯啶虫胺271.0237.015224.0151005.126久效磷224.0193.00127.0101005.18丁酮砜威223.0166.00106.05905.185涕灭威砜223.1148.05
14、76.05805.321百治磷238.0127.05112.115905.357抗蚜威239.2182.11572.0201205.562蚜灭多288.1146.110118.020805.734噻虫嗪292.0211.010181.020805.779双甲脒294.1163.010121.9351105.791速灭磷225.0193.01127.015806.0843-羟基克百威255.1220.15163.115706.13噻虫胺250.0169.05132.015906.16密草通226.2170.015142.0251006.203扑灭通226.2184.120142.1201206.
15、244特丁通226.2170.115114.1201206.244非草隆165.1120.01572.0151206.29西草净214.1144.120124.1201206.301吡虫啉256.1209.110175.010806.342三环唑190.0163.025136.0301206.391乐果-d6236.0205.05171.010806.437乐果230.0199.05171.010806.437啶虫脒223.1126.01556.015806.443抑霉唑297.1255.020159.0201606.6丁噻隆229.1172.115116.0201206.768甲氧隆229.
16、1156.02072.0201206.77霜脲氰199.1128.15111.015806.813莠灭净228.1186.12096.1251206.919长杀草237.1192.15118.010806.932噻虫啉253.0186.010126.0151206.937盖草津272.2198.120170.1301406.97噻唑隆222.1165.115150.0201207.097噻苯隆221.0128.012102.081007.097涕灭威116.189.0570.05807.107丁苯吗啉304.3147.130130.0301207.114螺环菌胺298.3144.120100.1201207.168乙螨唑360.2141.028113.0501557.2136化合物母离子MRM 1碰撞能量1 (V)MRM 2碰撞能量2 (V)碎裂电压(V)保留时间(min)恶霜灵279.1219.110102.010807.236甲基托布津343.0192.021151.02
