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1、广州医学院硕士学位论文AMPK通过mTOR途径影响大鼠血管平滑肌细胞增殖的研究姓名：张萌申请学位级别：硕士专业：心血管内科学指导教师：吴峻;王玮20100601广州医学院硕士学位论文 AMPK 通过 mTOR 途径影响大鼠血管平滑肌细胞增殖的研究 2AMPK 通过通过 mTOR 途径影响大鼠血管途径影响大鼠血管 平滑肌细胞增殖的研究平滑肌细胞增殖的研究 研究生：张萌 导 师：吴峻 副教授 王玮 主任 广州医学院第一附属医院心血管内科 研究生：张萌 导 师：吴峻 副教授 王玮 主任 广州医学院第一附属医院心血管内科 中文摘要中文摘要 研究背景 研究背景 冠状动脉支架植入术是目前治疗冠心病的主要方
2、法，它显著降低了急、慢性冠状动脉事件的发生率和死亡率，但支架置入仍面临再狭窄的问题。虽然药物洗脱支架可使 6 个月内的再狭窄发生率降到 5%，但对于一些冠脉复杂病变和存在高危因素的患者其再狭窄发生率仍高达 10%50%1。 PCI 与 CABG 对多支冠脉病变患者的远期安全性和疗效比较：ARTS、ERACI-II、MASS-II 和 SoS 试验 5 年荟萃分析，虽然提示 PCI 和 CABG 的远期安全性相近， 但同时也指出 CABG 组需要再次介入治疗的患者比例较低， 术后 5年 CABG 组总体的主要不良心脏事件和心血管事件的发生率显著低于 PCI 组2，这也从侧面说明了降低患者再次 P
3、CI 具有重要意义。研究证实，血栓、炎症及血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的增殖是引起的血管重建，造成血管再狭窄的 3 个重要方面，其中 VSMC 的增殖是触发整个血管内膜增生的始动因素3。如何预防和阻止 VSMC 的异常增殖，对防治血管成形术后再狭窄改善患者的预后具有重要意义。 AMP 激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是一个异源三聚体，在体内葡萄糖缺乏、缺氧、缺血及热休克等引起 AMP/ATP 比率升高的情况下均能引起细胞内 AMPK 的激活4，激活的 AMPK 除在能量代谢方面起重要的调
4、节作用，还在基因水平参与细胞内转录调节，影响细胞分裂周期5，引起VSMC 的分裂增殖周期停滞从而抑制其增殖6。 广州医学院硕士学位论文 AMPK 通过 mTOR 途径影响大鼠血管平滑肌细胞增殖的研究 3哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，mTOR 在细胞生长、增殖及分化中具有重要的调节作用7。mTOR 诱导密码子翻译起始8，影响细胞 DNA 复制、分裂周期的 G1/S/G2转变。 Kimura 等9 的研究认为激活的 AMPK 可以抑制由生长因子和氨基酸刺激激活的mTOR信号途径， 也有研究指出AMPK可
5、以通过抑制翻译延伸因子 （EF2）减少蛋白质的合成10。 AMPK 的这种作用为防治血管平滑肌细胞增殖性疾病提供了一个新的方向， 本研究通过观测激活的 AMPK 对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 （mammalian target of rapamycin，mTOR）表达及活性的影响，进一步探讨和认识影响 VSMC 增殖的作用途径。 研究目的和内容研究目的和内容 用体外组织块细胞培养方法，培养并鉴定 SD 大鼠胸主动脉 VSMC。观察在血清培养条件及 PDGF-bb 刺激因子作用下， 激活的 AMPK 对 SD 大鼠 VSMC 增殖的影响，通过检测激活的 AMPK 对 VSMC 的 mTOR 表达和活
6、性的影响，进一步探讨 AMPK 对血管平滑肌细胞增殖的影响，为防治非正常途径下 VSMC 的增殖提供新的线索和理论依据。 研究方法 1.研究方法 1.SD 大鼠胸主动脉大鼠胸主动脉 VSMC 培养 培养 SD 雄性大鼠购自广东实验动物中心 （粤监证字 2008A002） ， 质量 200300g，戊巴比妥麻醉后，无菌状态取出胸主动脉，采用组织块贴壁培养法，传代筛选后用 -actin 平滑肌细胞检测试剂盒鉴定细胞。0.25%的胰酶消化传代。采用 46代细胞进行实验。 2.2.SD 大鼠大鼠 VSMC 细胞生长曲线绘制 细胞生长曲线绘制 取 46 代细胞，观察并计数 VSMC 的生长，绘制细胞生长
7、曲线，找出细胞的对数生长期，从而确定药物干预时间。 3.3.Western blot 检测检测 AMPK 在在 VSMC 的激活 的激活 取第 4 代 VSMC，经 AICAR 干预后，分别在时间点 30min、1h、3h、6h、12h、24h 抽提细胞总蛋白，用 Western blot 检测 AMPK 在 VSMC 的激活。 4.不同浓度4.不同浓度 AICAR 在不同时间点对在不同时间点对 VSMC 的增殖的影响 的增殖的影响 广州医学院硕士学位论文 AMPK 通过 mTOR 途径影响大鼠血管平滑肌细胞增殖的研究 4采用 MTT 法检测不同干预浓度的 AICAR 在 24h、48h、72
8、h 对细胞增殖的影响，酶标仪在 570nm 处记录 OD 值，每组 6 个复孔。 5.半定量5.半定量 RT- -PCR 检测检测 AICAR 干预后细胞干预后细胞 mTOR 的的 mRNA 的表达 的表达 取第 4 代 VSMC， 分别经不同浓度 AICAR 干预后， 用半定量 RT-PCR 方法，检测 VSMC 的 mTOR 在 mRNA 水平表达的变化。 6.6.Western blot 检测检测 AICAR 干预后细胞干预后细胞 mTOR 磷酸化水平的改变 磷酸化水平的改变 取第 4 代 VSMC，经相同浓度 AICAR 干预后，用 Western blot 检测不同时间点 mTOR
9、活性（p-mTOR）的改变。 7统计学分析 7统计学分析 计量资料以均数标准差(xs)表示， 统计方法用 SPSS l3.0 for Windows 软件包进行统计分析，多组之间比较采用方差分析，两组之间的比较采用 t 检验。P0.05 为差异具有统计学意义。 研究结果 研究结果 1. VSMC 的培养及鉴定的培养及鉴定 采用组织块贴壁培养法，组织贴块从第 3 天开始有细胞从组织块边缘爬出，从第 4 天开始由组织块爬出细胞逐渐增多，到第 14 天左右爬出的细胞逐渐铺满组织块周围的显微镜视野。传代培养到第 4 代细胞，细胞呈现血管平滑肌细胞典型的“峰-谷”样，“沟、壑”样生长的形态。经免疫组化染
10、色后，高倍镜下可见胞浆内阳性着色的丝状-actin 分布，鉴定为 VSMC 且 VSMC 的纯度99%。 2. VSMC 生长曲线的绘制生长曲线的绘制 取第 4 代 VSMC，采用细胞计数法，绘制 VSMC 生长曲线显示：从接种细胞 05.5 天，曲线呈“S”形，细胞在 24.5 天处于生长旺盛的增殖期，可排除来自细胞本身等影响因素对细胞增殖的影响，这段时间药物干预具有实际意义。 3. 不同浓度不同浓度 AICAR 在不同时间点对在不同时间点对 VSMC 的增殖的影响的增殖的影响 采用 MTT 法检测不同干预浓度的 AICAR 在 24h、48h、72h 时均可显著抑制两种条件（血清培养条件及
11、 PDGF-bb 刺激因子）下细胞增殖，呈一定的剂量依赖性，各组增殖数据差异具有统计学意义。 4. AICAR 干预后细胞在不同时间点检测干预后细胞在不同时间点检测 p-AMPK 的激活的激活 p-AMPK 和-actin 条带都出现在相应的分子量位置。采用 Quantity One 图广州医学院硕士学位论文 AMPK 通过 mTOR 途径影响大鼠血管平滑肌细胞增殖的研究 5像分析软件分析整理数据后显示，0.5 mmol/L AICAR 干预 30min 时 AMPK 开始激活，到 6h 时其激活程度达到最大，以后逐渐减弱，表明 AICAR 对 AMPK 的激活随时间逐渐增强后又逐渐减弱。 5
12、. 不同浓度的不同浓度的 AICAR 对细胞对细胞 mTOR 的的 mRNA 的表达的影响的表达的影响 从 PCR 电泳图像上， 可以看到 mTOR 和 GAPDH 条带都出现在相应的分子量位置。 采用 Quantity One 软件分析图像， 数据显示， 在 24h 时 mTOR 的 mRNA的表达随 AICAR 干预浓度增加其扩增量逐渐减少，各浓度组的灰度比值，差异具有统计学意义(P 99%. 2. VSMCs Growth Curve Mapping VSMCs growth curve in 4th generation of VSMCs: from the inoculated ce
13、lls to 5.5 days, curve “S“ shape, from 2th to 4.5th day in the logarithmic phase which can be excluded from cell itself and other factors on cell proliferation, drug intervention in this period has practical significance. 3. Detect the activation of p-AMPK at different time after AICAR intervention
14、Using Quantity One image analysis software collate data, AICAR(0.5mmol/L) activates AMPK from 30min, reaching the maximum in 6h, then gradually decrease. Indicating that with AICAR, the activation of AMPK increases gradually over time, then gradually reduced. 4. The proliferation of VSMCS with diffe
15、rent concentrations of AICAR at different time The cells proliferation can be inhibited in dose-dependent with different concentrations of AICAR intervention in 24h, 48h, 72h under the two conditions (serum culture and PDGF-bb factor)( P0.05）方差齐性，采用方差分析数据，各组数据间差异有统计学意义（ P0.05），但 3h、6h、12h 组分别与 30min
16、 和 24h时的数据差异有统计学意义（表 2）。 表 2 不同时间点 AICAR 对血管血管平滑肌细胞 p-AMPK 表达灰度值分析（xs） 对照组 30min 1h 3h 6h 12h 24h 对照组 30min 1h 3h 6h 12h 24h 0.1160.009 0.6760.087* 0.7500.135*0.9170.018* 0.9270.012* 0.9350.027* 0.6130.007*其中*表示 P0.05 VS 对照组；表示P0.05 1.21.2 p-AMPK 的表达变化的表达变化 分析图 1、2，表 2 数据，可以得出 0.5 mmol/L 的 AICAR 干预 VSMC 后30min 时 AMPK 开始显著激活， 到 12h 时其激活程度达到最大， 表明在 AICAR作用的至少前
