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1、1HPLC 法分析阿奇霉素及各类注射剂中有关物质的含量作者：王明娟 许明哲 胡昌勤* 王立新 王晨【摘要 】 目的 建立一种能用于阿奇霉素原料及制剂中有关物质控制的 HPLC 方法。方法 采用 XBridge Shield RP18 柱(250mm4.6mm，5m) ，柱温 30 ，流动相为乙腈pH8.2 磷酸盐缓冲液(0.05mol/L 磷酸氢二钾溶液，用 20%磷酸调节 pH 至8.2)(5545)，流速 1.0ml/min；检测波长 210nm；样品溶液的进样量为 200g。结果 阿奇霉素与其杂质(氮杂红霉素 A，红霉素 A肟，N 去甲基阿奇霉素，阿奇霉素德糖胺以及阿奇霉素 N氧化物)能
2、达到基线分离；盐酸、硫酸、乳糖酸、柠檬酸、马来酸等阿奇霉素注射剂中常用酸根对阿奇霉素有关物质的测定无影响；方法的线性、准确性、灵敏度以及粗放性均能满足要求。结论 本文所建方法能较好地反映国产各种阿奇霉素原料及制剂中的有关物质的情况，为国内市场上不同阿奇霉素注射剂的评价、阿奇霉素及其口服制剂的质量控制提供了较好的分析手段。 【关键词】 阿奇霉素； 有关物质； 原料； 制剂ABSTRACT Objective To develop an HPLC method for 2determination the related substances of azithromycin in parenter
3、al products. Method The separation was performed on a column of XBridge Shield RP18 (250mm4.6mm, 5m), with acetonitrilepH8.2 phosphate buffer (0.05mol/L K2HPO4 solution, adjust pH to 8.2 with 20% phosphate acid) (5545) as the mobile phase at flow rate of 1.0ml/min. The detection wavelength was 210 n
4、m. The injection amounts of sample solutions were 200g. Result Azithromycin and its related substances, including azaerythromycin A, erythromycin A oxime, Ndemethylazithromycin, desosaminylazithromycin and azithromycin Noxide, can be well separated from each other on the developed system. The coexis
5、tence acids in azithromycin for injection e.g. HCl, H2SO4, lactobionic acid, maleic acid, citric acid, etc, did not interfere with the determination of the related substances. Linearity, accuracy, sensitivity and robustness of the method could meet the specific analytical requirements. Conclusion Th
6、edeveloped method can be successfully applied to the quality control of azithromycin drug substances and products.KEY WORDS Azithromycin; Related substances; Drug substances; Drug products3阿奇霉素为半合成碱性大环内酯类抗生素，由红霉素 A 生成9肟衍生物后发生 Bechman 重排，再经还原及 N甲基化而成。阿奇霉素在水中几乎不溶，在稀酸溶液中易溶；对酸较敏感，在酸溶液中可使阿奇霉素完全降解1 。中国药典
7、2005 年版中收载有阿奇霉素及其口服制剂，国内新药试行标准涵盖了各类注射用阿奇霉素原料(盐酸阿奇霉素、硫酸阿奇霉素、乳糖酸阿奇霉素、马来酸阿奇霉素、门冬氨酸阿奇霉素、阿奇霉素磷酸二氢钠、阿奇霉素柠檬酸二氢钠)及相应的注射剂( 粉针，小针剂及大输液) 。对上述原料及制剂的科学性评价已势在必行。有关物质检查是目前药品安全性评价的一个重要指标。虽然利用TLC 可以有效地控制阿奇霉素原料中的有关物质1 ，但 HPLC 法是最常用的有关物质检查方法之一。采用 HPLC 法分析阿奇霉素有关物质存在以下难点：与其它大环内酯类抗生素一样，阿奇霉素在紫外区仅具有末端吸收，限制了其检测灵敏度；阿奇霉素属碱性物质
8、，容易和色谱柱的硅醇基相互作用，导致色谱峰拖尾严重。中国药典 2005 年版以及国家食品药品管理局标准中对阿奇霉素原料及其制剂中“有关物质”的检查均采用薄层色谱法；国外药典则采用 LC末端检测或电化学检测法检查阿奇霉素有关物质(表 1)；另有文献报道2 ，即使采用偏碱性流动相，阿奇霉素及其杂质在普4通 C18 柱或铝基质色谱柱(USP 中的 L29 色谱柱) 中仍拖尾严重。新型的杂化颗粒色谱柱 XTerra RP18 能将阿奇霉素与其杂质较好的分离，该方法已被 EP5.0 版收载。本文参考国外药典3 5和文献2的色谱条件，以阿奇霉素及其主要杂质氮杂红霉素 A(azaerythromycin A
9、，EP 中杂质A)、红霉素 A 肟(erythromycin A oxime)、N 去甲基阿奇霉素(Ndemethylazithromycin)、阿奇霉素德糖胺(desosaminylazithromycin)、阿奇霉素 N氧化物(azithromycin Noxide)，结构示意图见图 1的分离情况为指标，建立了一种易在国内普及、专属性较好的 HPLC末端检测法。该法不仅能满足对阿奇霉素原料中有关物质的控制，且能较好的排除各种注射用阿奇霉素中各种酸根及其它辅料的干扰，并能满足对各类阿奇霉素输液相关物质检测的灵敏度。采用本方法分析阿奇霉素及各类注射剂中的有关物质含量，为阿奇霉素注射剂的评价提供
10、了科学的 表 1 国外药典中常用阿奇霉素有关物质检查方法的比较 数据。1 材料与方法1.1 仪器、试剂与样品岛津液相色谱系统：包括 LC20AT 型双泵，SIL20AC 型自动5进样器，SPDM 20A 型 PDA 检测器；Waters 液相色谱系统：包括 1525 型双泵，717plus 型自动进样器以及 2487 型双通道紫外检测器。磷酸氢二钾、磷酸均为分析纯级(北京化学试剂厂)，乙腈为色谱纯级(Fisher 公司)。阿奇霉素对照品( 批号 060090QCS)以及氮杂红霉素 A、红霉素 A 肟、 N去甲基阿奇霉素、阿奇霉素德糖胺、阿奇霉素 N氧化物等杂质对照品均由 Pfizer 公司提供
11、；阿奇霉素原料 (包括盐酸阿奇霉素、硫酸阿奇霉素、乳糖酸阿奇霉素、马来酸阿奇霉素、门冬氨酸阿奇霉素、阿奇霉素磷酸二氢钠、阿奇霉素柠檬酸二氢钠)及相应的注射剂(粉针，小针剂及大输液) 均为从流通市场上抽验到的国内药厂产品。1.2 溶液的制备(1)对照品溶液 取阿奇霉素及其杂质对照品，分别精密称定，用乙腈 水(6040)溶解并分别配制成约 0.1mg/ml 的溶液，用于有关物质峰定位以及方法学考察。分别精密量取 1ml，混匀，作为混合对照品溶液。6(2)样品溶液原料 精密称取适量，用乙腈水(6040)溶解(必要时先用乙腈助溶)并稀释成约 10mg/ml(以阿奇霉素计 )的溶液；粉针剂 采用整瓶稀释
12、法，按标示量用乙腈 水(6040)溶解并稀释成约 10mg/ml 的溶液；水针剂 取 5 支样品，混匀后，精密量取适量，用乙腈 水(6040)稀释成约 10mg/ml 的溶液；大输液 直接进样测定。1.3 色谱条件色谱柱：XBridge Shield RP18 柱(Waters 公司) ，250mm4.6mm，5m；CAPCELL PAK C18UG120(资生堂) ，150mm4.6mm，5m；Apollo C18(Grace 公司)，250mm4.6mm，5m 和 XTerra MS C18，50mm4.6mm，2.5m；柱温 30；乙腈pH8.2 磷酸盐缓冲液(0.05mol/L 磷酸氢
13、二钾溶液，用 20%磷酸调节 pH 至 8.2)(5545)；流速 1.0ml/min；检测波长 210nm；进样量为 20l(大7输液中由于阿奇霉素浓度很低，最高为 2mg/ml，故通过加大进样体积使总的进样量为 200g)。2 结果2.1 HPLC 方法的确定以阿奇霉素和 5 种阿奇霉素杂质的分离情况为指标，调整流动相使得阿奇霉素与诸杂质能达到较好的分离，且保持较好的峰形(图2)。本色谱系统对色谱柱有一定的选择性。阿奇霉素及其杂质在杂化颗粒的 C18 柱(XBridgeTM Shield RP18 和 XTerra MS C18)和聚合物包被的 C18 柱(CAPCELL PAK C18
14、UG120)中峰形较好， 但在普通耐碱色谱柱阿奇霉素及其杂质混合图谱(Apollo C18)中峰形不理想，且内嵌极性基团的 XBridge Shield RP18 柱的选择性与其它 C18 柱不同，内嵌极性基团的存在有利于难分离物质对 N去甲基阿奇霉素与阿奇霉素德糖胺的分离，建议采用硅胶表面经杂化处理的十八烷基键合硅胶色谱柱，如 XBridge Shield RP18(250mm4.6mm，5m)或与之相当的色谱柱，系统适用性指标采用：调节流动相比例，使阿奇霉素峰的保留时间约为11min，此时阿奇霉素 N氧化物、N 去甲基阿奇霉素、阿奇霉素德糖胺、氮杂红霉素 A 和红霉素 A 肟相对于阿奇霉素
15、的保留时间分8别为 0.35、0.48、0.52、0.58 和 0.62，上述杂质相对于阿奇霉素的校正因子分别为 0.62、0.70、1.66、0.77 和 2.94；阿奇霉素峰的拖尾因子不得大于 2.5；阿奇霉素对照品溶液在 100加热30min 后，阿奇霉素与其相邻降解杂质峰的分离度应符合规定(图3B)。2.2 方法学考察按中国药典 2005 版附录 XIXA6的相关规定，对所建方法的线性、定量限、检出限、精密性、粗放性和溶液的稳定性进行评价。上述方法检测阿奇霉素及其杂质的最低检出限、最低定量限、加样回收率及线性范围见表 2。取混合对照品溶液 200l，连续进样 5 针，各物质峰面积的RS
16、D 均小于 0.4%；取不同时间配制的阿奇霉素对照品溶液进样，其响应值的 RSD 小于 0.5%(n=3)；说明方法的精密性良好。采用岛津或者 Waters 液相色谱系统分析阿奇霉素原料及其制剂中的有关物质，方法的灵敏度、专属性均能满足要求。 *：采用有关物质已知的注射用阿奇霉素，利用标准物质加入法(各杂质浓度分别约为0.08、0.10 和 0.12mg/ml，n=3) ，考察方法的回收率；*：以进样量 200g 计算。冬氨酸、磷酸二氢钠、柠檬酸二氢9钠等酸根对阿奇霉素有关物质分析的影响，结果表明上述酸根均在接近死体积的位置(RRT 约为 0.27)出峰，均不干扰有关物质的测定。阿奇霉素溶液对酸和热不稳定，在 0.1mol/L 盐酸中放置 24h 后主峰完全消失(图 3A)，所形成的杂质经杂质对照品比对及 LCMS确认(流动相同本
