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1、1CpGN ODN 对 CpGS ODN 诱导 hPBMC 释放TNF的抑制作用作者：蒋为薇 王良喜 丁国富 余双江【摘要 】 目的 明确抑制性 CpG ODN 208(CpGN ODN)对刺激性 CpG ODN 1826(CpGS ODN)诱导单核/ 巨噬细胞分泌TNF的影响，为通过拮抗细菌 DNA达到防治脓毒症的目的提供实验依据。方法 选用本室前期筛选出的对 CpGS ODN活化 RAW 264.7细胞有抑制作用的 CpGN ODN，观察其对 CpGS ODN诱导 hPBMC释放 TNF的影响；应用流式细胞术观察 CpGN ODN对 CpGS ODN与 hPBMC表面结合和内化的影响。结果
2、 浓度比为 11的 CpGN ODN对刺激性 CpGS ODN诱导 hPBMC分泌 TNF具有抑制作用，并呈一定时效关系；CpGN ODN对CpGS ODN在 hPBMC细胞表面的结合和内化具有抑制作用。结论 CpGN ODN对 CpGS ODN活化 hPBMC具有抑制作用，这个作用可能与其影响 hPBMC的表面结合和内化 CpGS ODN有关。【关键词】 脓毒症 抑制性 CpG ODN 刺激性 CpG ODN TNF 表面结合 内化2ABSTRACT Objective To study the influence of CpG ODN 208 (CpGN ODN) on TNF relea
3、se from hPBMC induced by CpGS ODN 1826 (CpGS ODN). Methods CpGN ODN, selected by the previous work in our lab, can inhibit TNF release from RAW264.7 induced by CpGS ODN. The influence of CpGN ODN on TNF release from hPBMC induced by CpGS ODN was measured by ELISA. The effects of CpGN ODN on the surf
4、ace binding and internalization of CpGS ODN were tested by flow cytometry. Results CpGN ODN could inhibit TNF release from hPBMC induced by CpGS ODN at the concentration ratio 11 in a timedependent manner. CpGN ODN could inhibit the surface binding and internalization of CpGS ODN. Conclusion CpGN OD
5、N could inhibit TNF release from hPBMC induced by CpGS ODN, which partly attributed to inhibition of CpGN ODN on the surface binding and internalization of CpGS ODN.KEY WORDS Sepsis; CpGN ODN; CpGS ODN; TNF; Surface binding; Internalization3脓毒症(sepsis)是一种严重创伤和感染的引起全身炎症反应综合征(systemic inflammatory res
6、ponse syndrome，SIRS) ，由其发展来的多器官功能不全综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)病死率高达 30%50%，但目前尚无有效的防治措施1 。细菌基因组 DNA(细菌 DNA)是 SIRS的主要启动因子之一。未甲基化 CpG的寡核苷酸片段(CpG oligonucleotides，CpG ODN)是细菌 DNA的免疫刺激作用的最小作用单位，广泛存在于细菌 DNA中2 。细菌 DNA之所以被哺乳动物视作异己成分而启动防御反应，是因为其有着与不如 DNA明显不同的结构特征：细菌 DNA中的 CpG二核苷酸出现的频率约为 1/
7、16，而哺乳动物 DNA中的 CpG二核苷酸出现的频率仅为1/64，并且 80%发生甲基化3 。研究者们发现只有含有未甲基化CpG为核心的特定六核苷酸序列的 CpGODN才具有刺激性， 这些特定的六核苷酸被称为刺激性 CpG基序 (stimulatory CpG motif，CpGS ODN)3 。Krieg 等通过对 Adv2 DNA、Adv5 DNA、Adv12 DNA和大肠埃希菌 DNA发现部分 CpG ODN对细胞的刺激活性较弱，并能对 CpGS ODN活化细胞有抑制作用，因此推断这些序列可能是中和性 CpG基序(neutralizing CpG motif；CpGN ODN)4 。由
8、于上述研究中发现的 CpGN ODN活性并不稳定，因此在 Krieg的研究基础上，我们进一步寻找并得到有效的 CpGN ODN：CpG ODN 208(5TGCCGCGGCAGA3)，CpG ODN 208对 RAW264.74细胞的刺激活性较弱，并对 CpGS ODN活化的细胞具有抑制作用。因此，本研究以 CpGN ODN和 CpGS ODN共同诱导人外周血单个核细胞(human peripheral blood mononuclear cells，hPBMC)，观察 CpGN ODN对 CpGS ODN诱导hPBMC分泌 TNF的影响，进一步探讨其可能的作用机制。1 材料和方法1.1 材料
9、全硫代修饰的 CpG ODN 208(CpGN ODN)：5TGCCGCGGCAGA3，由大连宝生物公司合成；全硫代修饰的CpG ODN 1826(CpGS ODN)：5TCCCTGACGTTCCTGACGTT3和 6FAM标记的 CpG ODN 1826由上海博亚生物技术有限公司合成。淋巴细胞分离液购自挪威AxisShield公司，比重 1.077。RPMI 1640培养液购自 Hyclone公司，胎牛血清购自 PAA公司。人 TNF检测试剂盒购自Bioscience公司。实验用移液管，吸管，离心管等玻璃器材均经260高温 3h去热原处理；培养板购自 BD公司，无热原，一次性使用。1.2 h
10、PBMC的分离5按淋巴细胞分离液说明书进行，密度梯度离心法。无菌静脉穿刺采血，肝素抗凝。在 8ml离心管中加 3m1淋巴细胞分离液，取5m1抗凝血加到分离液液面上，2000r/min 离心 15min。小心吸取中间白膜层，转到新的离心管内，用冷生理盐水洗涤 2次，1500r/min离心 6min弃上清，加 2m1 RPMI 1640培养液(含 10%胎牛血清、100u/ml 青霉素、100u/ml 链霉素)，吹匀制成细胞悬液备用。1.3 CpGN ODN抑制 CpGS ODN诱导 hPBMC分泌细胞因子的作用调整 hPBMC悬液浓度为 1106/ml，取 0.2ml细胞悬液加于96孔板内，置
11、37 CO2温箱培养 2h，同时加入0、10 、20、30、40、50g/ml CpGN ODN和 10g/ml的CpGS ODN，每组设 3复孔，另设阳性对照组加入 100ng/ml LPS，置 37继续培养 8h，取 100l上清，所有上清立即进行ELISA检测 TNF。1.4 CpGN ODN抑制 CpGS ODN诱导 hPBMC分泌细胞因子的时效关系6按上述方法将 hPBMC加于 96孔板后，置 37 CO2温箱培养2h，CpGN ODN相对于 CpGS ODN的时相点分别为-2、-1、0 、1 和 2h，CpGN ODN和 CpGS ODN均为 10g/ml，每组 3复孔，另设阳性对
12、照组， 0时相点加入 100ng/ml LPS。置37继续培养 8h后取 100l上清测定 TNF。1.5 CpGN ODN与 CpGS ODN预孵对 hPBMC分泌细胞因子的影响实验按上述方法将 hPBMC加于 96孔板后，置 37 CO2温箱培养2h，将一组 CpGN ODN和 CpGS ODN各 10g/ml预孵 2h，另一组的 CpGN ODN和 CpGS ODN不预孵，直接加入hPBMC中，每组 3复孔。置 37继续培养 8h后取 100l上清测定 TNF。1.6 CpGN ODN对 hPBMC表面结合 CpGS ODN的影响调整 hPBMC悬液浓度为 1106/ml，按每孔 0.5
13、ml加入 24孔板内，同时加入 10g/ml的 CpGN ODN和 56FAMCpGS ODN；另设阳性对照：加入 10g/ml的 56FAMCpGS ODN；阴性对照：未加任何处理。4 避光继续培养 30min后取出，采用流式技术检测。71.7 CpGN ODN对 hPBMC内化 CpGS ODN的影响调整 hPBMC悬液浓度为 1106/ml，按每孔 0.5ml加入 24孔板内，同时加入 10g/ml的 CpGN ODN和 56FAMCpGS ODN；另设阳性对照：加入 10g/ml的 56FAMCpGS ODN；阴性对照：未加任何处理。37避光继续培养 2h后取出，采用流式技术检测。1.
14、8 统计学处理所得数据均以s 表示，应用 Microsoft Excel进行统计分析处理，P0.05 为有显著性差异。2 结果2.1 CpGN ODN抑制 CpGS ODN诱导 hPBMC分泌TNF的作用加人不同浓度(10 50g/ml)CpGN ODN后，当 CpGN ODN与 CpGS ODN浓度比为 11时，hPBMC 释放细胞因子的作用受到抑制(P0.05)；而其它比例剂量时未见抑制作用，但也8无协同或相加作用。因此我们在 11的浓度比条件下研究其量效关系：提前和与 CpGS ODN同时给 CpGN ODN均可抑制hPBMC分泌细胞因子(P0.05) ，且抑制效果相当，约为 25%；延
15、后给则未见抑制效应(Fig.1)。2.2 CpGN ODN与 CpGS ODN不直接结合和相互作用为观察 CpGN ODN对 CpGS ODN的抑制作用是否因为其直接作用引起，将 CpGN ODN与 CpGS ODN进行预孵，如果是直接相互作用引起，则预孵组的抑制细胞因子释放的效果可能更好。结果显示，CpGS ODN预孵与否对 hPBMC释放 TNF没有影响，说明预孵 CpGN ODN和 CpGS ODN对 CpGN ODN的抑制作用没有影响，CpGN ODN与 CpGS ODN并非直接结合和相互作用(Fig.2)。2.3 CpGN ODN抑制 CpGS ODN在 hPBMC表面结合和内化 CpG ODN与细菌表面接触后被细胞吞噬、内化进入，形成早期内体。早期内体与溶酶体融合形成晚期3 讨论Krieg等 4有关腺病毒 DNA的研究提示，A 亚属的血清型12腺病毒(Adv12) 和 C亚属的血清型 2、5 腺病毒(Adv2 、Adv5)，9其 DNA都含有与大肠埃希菌 DNA(EC DNA)相似频率的未甲基化CpG二核苷酸，且均含有较多的 CpGS基序，但却有截然不同的免疫活性：其中 Adv12有着与 EC DNA相似的刺激性，而 Adv2和 Adv5 DNA不但无刺激性，还能
