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1、福建医科大学硕士学位论文冷冻扩张成形术治疗外周动脉病的动物实验研究姓名：吴正忠申请学位级别：硕士专业：影像医学与核医学指导教师：杨维竹20090301冷冻扩张成形术治疗外周动脉病的动物实验研究I 摘要l 目的：探讨犬髂动脉狭窄的动物模型建立；比较普通球囊和冷冻 扩张成形术对犬狭窄髂动脉的作用，探讨低温冷冻扩张对动脉狭窄的治 疗机制。 方法：采用手术结扎和缝扎方法建立犬髂动脉狭窄模型。将髂动脉狭窄 犬模型随机分成两组，A 组一冷冻扩张组和B 组一球囊扩张组，每组各 8 只。A 、B 两组经不同干预后即时和2 周后进行D S A 造影检查，并取 出目标血管行病理形态学及免疫组化检查。 结果：采用手
2、术结扎和缝扎方法建立犬髂动脉狭窄模型16 只，成功率 达10 0 。狭窄血管经普通球囊和冷冻扩张成形后即时造影显示A 组残 存狭窄约( 4 5 12 2 5 ) ，B 组残存狭窄约( 3 8 7 5 12 17 ) ，狭窄程度无 明显差别：2 周后A 组血管狭窄程度约( 4 S 17 4 7 ) ，与术后即时造影 比较血管狭窄程度无明显差别( t = 一1 2 71 ，P = O 2 4 4 ) ；B 组血管狭窄约( 6 6 8 8 13 35 ) ，与术后即时造影比较血管狭窄程度有明显差别( t = 一 6 6 6 6 ，P 5 0 合计球囊组( B )I78 冷冻组( A )628 合讨F
3、 i s h e r 确切概率法P = 00 4 0 6 0 0 5 外膜尸 0 0 1 ：球囊组与对照组比较，内膜尸 0 0 1 中膜尸 0 0 l 外膜P 0 0 l 。2 T I M P 2 蛋白的表达水平球囊扩张组显著增生的内膜阳性细胞数少，以内膜下内皮细胞表达较多，颜色较深，V S M C 表达很少，颜色较浅，但范围较弥漫，中膜和外膜的阳性细胞明显减少( 图2 5 ) 。冷冻扩张组新生内膜，阳性细胞数明显增加，染色最强的区域在内膜层的近管腔面，近内弹力板处T I M P 2 也有明显的表达，中膜和外膜的阳性细胞也较明显( 图2 6 ) 。对照组、球囊扩张组与冷冻扩张组之间T I M
4、P 2 蛋白的表达水平存在显著差异( P O 01 ) ( 表5 ) 。表5术后2 周各组T I M P ，2 蛋白在血管壁各层的表达( x s ) ( )注t 各组比较，内膜、中膜、外膜尸 0 01 。j j ：图2 0 正常束损伤的血管壁也表达M M P ，2 ，但量较少，以内膜下内皮细胞表达较多，颜色较深( 4 0 ，D A B 显色)曼j 1 曼 箩张菪后2 周内膜增厚，阳性细胞数增加更明显，染色最强的区域在内膜层的近管腔呵，近内弹力板处M M P 2 也有苗i 晶 表达( 4 0 ，D A B 显色)，曩、一二JT舞0趣F簿群伊P 戴炒，谰坼谶| 笙| 2 2 冷冻扩张后2 闰，血管
5、罐表达M M P 2 量较少，以内膜下内皮细胞 表达较多，颜色较深，V S M C 表达很少，颜色较浅( 4 0 ，D A B 显色)图2 3 空白对照，：螭砖o。霹苣图2 4 正常血管壁内膜束见明显T I M P 2 阳性染色( 4 0 ，D A B 显色)图2 5 球囊扩张后2 周，显著增生的内膜T I M P - 2 阳性细胞数少，阻内膜下内皮细胞表达较多，颜色较深，V S M C 表达很少，颜色较浅但范围较弥漫( 4 0 ，D A B 显色)图2 6 冷冻扩张后2 周新生内膜，阳性细胞数明显增加，染色是强的区域在内膜层的近管腔面，近内弹力板处T I M P 2 也有明显的表达( x 4
6、 0 ，D A B 显色)图2 7 空白对照讨论一、关于动脉狭窄动物模型的建立。动脉狭窄动物模型是研究外周动脉病病理生理机制和进行临床治疗的基础。目前用于研究的狭窄动物模型很多，模型制作常用的方法有：1 、高脂饮食法，该法是对动物进行高脂饮食喂养2 3 个月，使其动脉发生粥样硬化而狭窄，该法符合血管狭窄的病理生理过程，但建立模型耗时长、效果不稳定、目标血管部位不明确，而且成功率极低，多与其他方法联合应用。2 、球囊导管损伤法，该法应用球囊导管对血管内皮进行损伤，使其内膜修复增生而狭窄。是建立血管狭窄动物模型最常用的方法。球囊对血管内皮的损伤程度、损伤时间和血管狭窄程度密切相关，此法制作狭窄模型
7、成功率较低，并且动物死亡率高。3 、手术结扎法，该法是采用手术暴露目标血管，并对其进行结扎所制作的模型，这种方法仅单纯引起管腔内径狭窄，血管内膜是正常的，与实际病变血管存在不同。而且在术中绑扎血管时，由于结扎线的松紧程度、绑扎范围等因素难以控制，动脉狭窄程度不恒定。为了取得较好的狭窄模型制作效果，本研究的模型在尚氏经腹膜外作髂动脉部分结扎建立了犬髂动脉狭窄模型【l 】基础上，用羊肠线先纵行缝合动脉再结扎内衬钢针髂动脉，成功地复制了动脉狭窄模型，探索出动脉中、内膜联合损伤制作血管狭窄的新方法。( 一) 本实验制作的动脉狭窄模型的优点：1 操作简便我们所采用的是经腹膜后髂动脉部分手术结扎缝扎的方法
8、，该法简便，无需特殊训练。并选用血管直径较大的犬，术中易于操作。2 动物损伤小，死亡率低本法在手术入路上，与常规开腹方法不同，采用经腹膜后入路，此法对动物损伤小，且手术耐受性好，动物的总死亡率为0 ( 0 16 ) ，较中文江等【2 】报告的球囊扩张成形再狭窄模型的死亡率51 ( 31 6 0 ) 为低，能够达到建立动物模型所要求的低死亡率的目标。3 部位明确，成功率高本实验所制作的模型，狭窄动脉部位均进行血管造影检查，所以能在整体状况下确定动脉的狭窄部位和狭窄程度。本组l6 根实验动脉全部发生狭窄，成功率达到10 0 ，我们分别在术后即时、术后4 周行血管造影检查，结果表明所有狭窄模型均有狭
9、窄。可见本法制作的动脉狭窄模型成功率高。4 高效、可靠本法采用结扎法使血管外膜和中膜损伤，同时也采用缝扎法造成内膜损伤，这种联合损伤中、内膜的方法可在短时间内造成动脉狭窄模型。血管造影检查亦表明，血管结扎缝扎后当时即造成6 0 左右的血管狭窄，术后4 周造影检查，血管狭窄明显加重，达9 0 以上。( 二) 动脉狭窄的机制探讨。动脉狭窄主要是由于血管内膜增生、血管重塑引起管腔狭窄，而内膜增生的主要原因是血管壁的损伤。1 内膜损伤是引起新生内膜发生和发展的基础。引起内膜增生的主要原因是内膜表面的上皮细胞的受损。引起内膜表面的上皮细胞的受损方法主要是机械损伤和化学刺激。无论是毕氏动脉粥样硬化狭窄动物
10、模型1 3 】，童氏用动脉球囊导管造成的狭窄动物模型【4 1 ，还是李氏在动脉粥样硬化的基础上用电刺激的方法建立动脉粥样硬化狭窄模型1 5 】，都是基于对动脉内膜的损伤。局部的内膜损伤使血管内皮剥脱，内弹性膜破裂，内皮下基质暴露，血小板和纤维蛋白迅速黏附至受损内皮和基质上，并释放各种细胞因子、趋化因子，促进白细胞的聚集，放大局部的炎症反应1 6 】。在炎症因子的作用，白细胞聚集黏附至受损的内皮和沉积的血小板、纤维蛋白的表面，并穿过、移行至内膜下转化为巨噬细胞。这些细胞所释放的损伤介质是内皮细胞和血管平滑肌细胞的丝裂原，进一步促进细胞增殖，导致新内膜生成，从而形成狭窄【7 1 。研究表明，新生内
11、膜厚度及管腔狭窄程度与血管损伤程度呈正相关。S c h w a r t z 8 】认为与血管大小匹配的球囊或支架仅引起轻微的增生反应，随着损伤程度的增加，新生内膜的厚度明显增加。由此可见动脉内膜损伤是造成血管狭窄的重要条件。但单纯的内膜损伤引起动脉狭窄较轻微，且狭窄程度不一。2 中膜损伤是导致动脉形成狭窄的重要条件。新生内膜的形成过程主要是细胞增殖以及细胞外基质( E C M ) 的合成。新生内膜细胞主要来源于动脉中膜、外膜。动脉中膜、外膜损伤，引起内弹力板断裂或中膜撕裂，中膜平滑肌细胞或外膜成纤维细胞向内膜迁移，过度增殖，分泌细胞外基质，导致内膜增厚，管腔狭窄。研究表明内弹力板的断裂和中膜撕
12、裂，使中膜平滑肌细胞暴露在多种生长因子和血管活性物质的刺激下，开始由动脉中膜向内膜迁移、增殖，细胞外基质也逐渐增多，最终形成新生内膜。可见中膜损伤是导致动脉形成狭窄的重要条件。但单纯的中膜损伤仅引起管腔内径缩窄，血管内膜是正常的，使中膜平滑肌细胞迁移增殖受限，血管狭窄程度有限。3 内膜和中膜联合损伤是血管狭窄的主要原因。在正常动脉内膜中不存在V S M C t9 1 。正常V S M C 位于血管中膜，周围为基质膜所包绕，基质膜对V S M C 的运动发挥着生物学和机械屏障作用，其与V S M C 接触可维持其处于收缩基因型，限制其移动，使其处于静止状态【l0 1 。当中内膜联合损伤时，损伤的
13、内膜产生各种因子，这些因子作用于中膜损伤后暴露的平滑肌细胞，使中膜V S M C 激活、收缩型V S M C 迅速转变为合成型，增殖并分泌细胞外基质。同时V S M C 向内膜迁移，随后血小板沉积和聚集，纤维蛋白沉着，血栓形成，以及血小板活化物质和肌细胞源性介质的释放，促使V S M C 转化，并产生大量细胞外基质，导致内膜增厚、管腔狭窄。本组l6 根实验动脉全部发生狭窄，发生率达到10 0 ，可见动脉内中膜联合损伤是引起动脉狭窄主要原因。血管狭窄的发生是一个由内膜增生与动脉壁重构共同参与的复杂过程。大量的动物实验证明，新生内膜增生不是动脉损伤后狭窄的唯一机制，动脉重构在此过程中也起了主要作用
14、。可见动脉狭窄的主要机理为血管中、内膜损伤，平滑肌细胞的迁移、增殖，细胞外基质合成，损伤动脉段的弹性回缩，管壁重塑等所造成的。1 5 】。二、冷冻扩张治疗动脉狭窄的机制。低温扩张术是低温疗法和P T A 的结合，它既包括了机械性的扩张，也包括了低温疗法的生物学效应。多中心研究表明：血管结构在冷冻的情况下，内膜会发生一定程度的反应，而整个血管功能却不受影响【1 6 j 。( 一) 低温冷冻治疗可减少细胞外基质合成，减轻细胞外基质降解，降低V S M C 迁移。1 低温冷冻治疗可减少细胞外基质合成。血管壁由细胞和细胞外基质组成，细胞外基质主要由增殖的血管平滑肌细胞和成纤维细胞所分泌，主要成分有胶原
15、、弹力纤维、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白和透明质酸等。胶原是E C M 的主要成分，血管壁细胞间的胶原以I I I I 型为主，I v 型胶原参与基底膜的形成。E C M 与V S M C的迁移增殖有着密切关系，前者各成分改变是后者迁移增殖的条件。在E C M 作用下V S C M 经表型转化才能产生其在血管狭窄中的功能。细胞外基质过量分泌和积累是内膜增生的主要原因之一。本实验H E 染色和M a s s o n 染色结果显示，冷冻扩张后内皮细胞受损，但内弹力层断裂不明显，内膜下增殖细胞少，胶原明显减少，新生内膜增生不明显，管腔狭窄较轻。球囊扩张组内皮细胞受损，内弹力层断裂，中膜V S M C s
16、 穿过断裂的基底膜移行至内膜，大量平滑肌细胞增殖和胶原增生，新生内膜增厚明显，引起管腔狭窄。家犬髂动脉冷冻扩张后和球囊扩张后的胶原含量比较明显减少。可见冷冻扩张后细胞外基质合成减少。可能是降低V S M C 迁移，减少细胞增殖，使胶原合成减少，而减轻了内膜增殖。因此认为细胞外基质合成减少是冷冻扩张治疗的机制之一。2 低温冷冻治疗可减轻细胞外基质降解，降低V S M C 迁移。血管再狭窄形成过程中基质金属蛋白酶及其抑制剂起重要作用。基质金属蛋白酶( M M P s ) 能够催化降解V S M C 周围基底膜，促进平滑肌细胞转化迁移，形成新生内膜，造成血管损伤后狭窄。金属蛋白酶组织抑制物( T I M P s ) 是M M P s 的天然抑制剂，对M M P s 基质降解起着重要的平衡作用，二者是调节E C M 动态平衡的重要酶系。2 1M M P s 在细胞外基质中的作用。M M P s 是一组锌
