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1、东南大学硕士学位论文去铁胺对白血病细胞K562/A02作用机制的研究姓名：王婷申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：陈宝安20110528中文摘要中文摘要去铁胺对白血病细胞K 5 6 2 A 0 2 作用机制的研究东南大学医学院内科学血液专业硕士研究生王婷导师陈宝安目的本研究探讨铁螯合剂去铁胺( d e f e r o x 锄i n e ，D F O ) 对人白血病耐阿霉素细胞K 5 6 2 A 0 2 的凋亡基因b a x 、b c l - 2 以及多药耐药基因l ( m u l t i d m gr e s i s t a n c eg e n e1 ，m d r l )P - 糖蛋白(
2、 P g l y c o p r o t e i I l ，P g p ) 表达影响，并探讨其诱导细胞凋亡及逆转多药耐药的可能机制，为白血病的治疗提供理论基础。方法采用四甲基偶氮唑蓝法( 3 - ( 4 ，5 D i m e t h y l t h j a z o l - 2 一y 1 ) 一2 ，5 d i p h e n y l t e t r a z o l i 啪b r o m i d e ，M T T ) 检测不同浓度D F O 对K 5 6 2 A 0 2 细胞和K 5 6 2 细胞增殖抑制效应；流式细胞仪法( n o wc y t o m e n y ，F C M ) 分别检测2
3、 5 、5 0 、l o o 和2 0 0um o 儿D F O 单独或联合1 m L 阿霉素( a d f i 锄y c i n ，A D M ) 作用K 5 6 2 A 0 2 细胞4 8 小时细胞的凋亡率；应用4 ，6 二脒基2 苯基吲哚( 4 ，6 一d i a m i d 洒o 2 - p h e n y l i n d o l e ，D A P I ) 染色观察凋亡细胞形态；半定量R T - P C R 检测各组细胞凋亡基因b a ) ( 、b c l 2 以及m d r lm I W A 水平变化：W e s t e mb l o t 检测各组细胞P g p 蛋白表达水平。结果K
4、 5 6 2 A 0 2 与K 5 6 2 对A D M 的I C 5 0 值分别为( 1 4 6 士0 0 7 ) m g L 和( 4 0 9 8 士3 0 5 ) m g L ，耐药倍数为2 8 0 6 倍。予2 5 、5 0 、10 0 和2 0 0 | lm o l LD F O 作用后，K 5 6 2 A 0 2 细胞对A D M的耐药倍数分别为2 4 9 5 、1 6 1 1 和9 9 9 倍。予以1 2 5 、2 5 和5 0 岬。儿D F O 单独处理K 5 6 2 A 0 2 细胞4 8 小时，凋亡率分别为( 3 5 0 士O 3 0 ) 、( 7 2 7 士O 3 2 )
5、 和( 1 2 5 3 士1 2 1 )，对照组K 5 6 2 A 0 2 细胞凋亡率为( 1 9 0 士O 1 0 ) ，当1 2 5 、2 5 和5 0 肛m 0 儿D F O 联合1 m g LA D M 处理K 5 6 2 A 0 2 细胞4 8 小时，凋亡率分别为( 6 1 3 士0 2 9 ) 、( 9 5 7 士0 4 0 ) 和( 1 8 9 7 士1 1 0 ) ，各组问均存在统计学差异( 尸 1 0 0 0 p g L 或患者3 岁，或已输血约2 0 次时，应进行铁螯合治疗。一项研究重度铁过载患者服用D F S 后的疗效评估指出每日剂量2 0m ( k g d ) 可2 4
6、 小时持续降低不稳定血浆铁( 1 a b i l ep l a s m ai r o n ，L P I ) ，有效降低组织铁，预防终末器官损害【1 6 】。2 2治疗性处理长期输血患者己出现心脏、肝脏等器官损伤，如面色铁青、心力衰竭、心律不齐、肝硬化、生长发育障碍、糖尿病等，应进行去铁治疗。对于输血依赖的大部分继发铁过载的患者，药物除铁更加有效、安全。2 2 1去铁胺( D e f e r o x a m i n e ，D F O )去铁胺从2 0 世纪6 0 年代早期开始应用于临床治疗，是目前应用最为广泛且效果最好的铁螯合剂，临床应用时间长，使用相对安全，除铁效率高，能有效维持体内铁平衡或4
7、东南大学硕士学位论文负铁平衡，持续使用去铁胺能显著减轻由铁过载引起的心脏毒性，相对较快地改善心室功能，纠正心力衰竭，逆转严重的心律失常。但近期大量临床试验也显示，D F 0 因其水溶性，不能进入细胞，仅能清除血液中的铁离子，也不能大量转移转铁蛋白结合的铁，即使患者接受正规的D F O 除铁治疗，心脏除铁的效果也是不理想的；而且半衰期短( 2 0分钟) ，需每次长时间皮下或静脉注射使用，依从性差。D F O 一般用于治疗输血所致的含铁血黄素沉着病，尤其是重型地中海贫血，铁粒幼细胞性贫血，自身免疫性溶血性贫血及其它慢性贫血等。国内外对于D F O 的治疗方案研究颇多，各种给药途径和剂量不尽相同。包
8、括皮下注射、静脉输注、持续静脉输注、肌肉注射D F O 、静脉+ 皮下输注、输血同时静脉应用D F O 等。其中，关于持续静脉输注，H a g e g e 等【17 】曾报道2 例地中海贫血患者，应用大剂量D F O ，每周输注 4 8 小时，治疗2 4 个月，结果显示2 例患者血清铁蛋白均显著下降，具有很好的顺应性和耐受性。另外，G 杨e v 等【1 8 】指出在骨髓移植期间应用D F O 不影响移植参数，不增加感染或G v H D发生率。静脉+ 皮下输注是D i 陆g o r i o 等【1 9 】曾报道的一种有效的治疗方案，3 4 例严重铁过量的地中海贫血患者，每月前1 0 天静脉输注D
9、 F 0 1 0 0m ( 埏d ) ，持续8 小时，后2 0 天皮下输注5 0m ( k d ) ，治疗8 个月后，血清铁蛋白和转氨酶水平明显下降，尿铁排泄量明显增多，其中1 5 3 4 例心脏病变患者心脏射血分数增加。近期一项临床试验报道，水飞蓟素与D F O 联合治疗p 地中海贫血患者，具有良好的耐受性，且降低血清铁蛋白水平较单独使用D F O 显著，这种联合治疗有可能安全、有效地应用于铁过载患者【2 0 1 。当然，各种治疗方案都应根据患者的病情及耐受程度来选择。D F O 毒副反应较少，偶见严重过敏反应，剂量过高可导致听力丧失、视力障碍、长骨生生障碍、肝肾功能损害等。国内外许多研究表
10、明，除长期或大剂量用药可引起视、听觉障碍外，对于儿童，低剂量和不规则使用D F O 也可引起损害，故患儿应在治疗前及治疗间每3 个月作一次眼科及听力检查。另有报道，过量或中毒可引起异亮氨酸降低、毛霉菌病、白内障、播散性毛霉菌性血管炎、鼻脑( 藻茵病) 毛霉菌病、肺毛霉菌感染虚盘寸oD F O 绝对大剂量与血清铁蛋白 3 0m ( 蚝d ) )和足量D F S 后的治疗效果，结果显示两组在C m 积、V 折、t l 2 没有差别【2 5 1 ，以生物利用度作为判定标准，口服的给药方式比非口服的给药方式更适合己发生铁超负荷不良反应的患者，表明D F S 口服的有效性。D F S 具有良好的耐受性和
11、动员组织铁的功效，促使铁排泄，治疗量可维持和降低输血患者肝内铁浓度，一项7 1 例B 地中海贫血患者参加的随机、开放、为期4 8 周的研究结果显示D F S l 0m ( k g d ) 能使肝内铁浓度( 1 i v e ri r o nc o n c e n t r a t i o n ，L I C ) 保持稳定，2 0m ( k g d ) 能使L I C 降低程度与D F 0 4 0m ( k g d )相似，且不会使Q T 间期延长，不必担心使用药物期间对心脏复极产生负性作用【2 6 1 ，D F S还可不同程度地改善心脏铁蓄积，同时由于D F S 在血浆中持续存在，可使血浆非转铁蛋白
12、结合铁持续减少，直接清除体内毒性形成的铁，同时减轻全身的铁负荷。若与D F O平行给药，结果在肝细胞铁库中，D F S 的螯合清除作用是后者的4 5 倍。国内目前正在进行临床研究。D F S 除了可用于治疗耐受或不愿意接受D F O 治疗的铁负荷过多的地中海贫血、镰刀状细胞贫血、先天性纯红细胞再生障碍性贫血等患者，也有报道用于治疗需要长期接受输血的低危组M D S 患者【2 7 】。同时，D F S 也有可能作为非输血引起的遗传性铁过载障碍( 如遗传性血色病) 治疗的一种补充手段，甚至替代放血术【2 8 】。一些研究【2 9 】表明较低剂量的D F S ( 5 1 0m ( k g d ) )
13、 只能用于轻度铁负荷过多、输血次数不多的年轻患者，或以往接受螯合剂治疗未获得满意疗效的老年患者；而使用D F S2 0 3 0m ( k g - d ) 的患者需仔细监测体内铁储备，因5 0 和1 0 的患者其机体铁水平仍可能持续升高。此外，输血频率也可影响D F S 控制肝脏浓度的效果，当铁摄入量大于0 5m ( 蚝- d ) 时，接受相同剂量D F s 的患者，其肝脏浓度获得降低者仅为4 7 。关于D F S 的最高剂量，许多国家公认3 0m ( 埏d ) ，但是一部分患者在接受此剂量治疗后，效果欠佳，必须增加剂量才能达到治疗的目标。另一项关于D F S 剂量 3 0m ( k g d )
14、 的有效性与安全性的回顾分析研究中指出，增加剂量能更加有效地降低血清铁7文献综述蛋白，减轻体内铁负荷，同时对于肾脏或是肝脏功能没有严重不良影响【3 0 】。因此，常用剂量并非绝对适用于每个患者，临床医师应根据实际病情调整用药剂量。I I I 期临床研究【3 1 】观察到大剂量使用D F S ，可出现某些急性不良反应，如胃肠道症状( 1 5 ) 和皮疹( 1 l ) ，但因这些症状而中断治疗者罕见。D F S 可引起肌酐水平升高，3 8 的患者肌酐水平升高达3 3 以上，而相应的接受D F O 治疗的患者，其肌酐升高到该水平的仅为1 4 ，但D F S 引起的肌酐水平升高一般不超过正常上限的2
15、倍，而且尚未见引起进展性肾脏疾病的报道，因此在服用D F S 期间每月应监测肾功能，同时每月应监测肝功能，若出现无法解释的、持续性或进行性转氨酶升高，则停药。同样为防止药物的肝脏、心脏毒性，每年监测4 次血浆铁蛋白浓度；每年测定肝脏铁浓度；1 0 岁及以上患者每年测定心脏铁浓度。2 2 4 联合治疗不同的铁螯合剂具有不同的化学特性及携带铁的能力，利用药物的器官选择性及不同的除铁机制，可以清除不同器官的铁。D F P 具有分子质量小、脂溶性、不带电荷等特点，它能很容易进入细胞，将细胞内的铁带入血浆，而D F O 能有效清除血浆中的铁，二者联合应用，可以产生协同效应，提高去铁治疗的效果。同时，铁螯
16、合剂的某些不良反应呈剂量依赖性，联合治疗能减少药物用量，从而减少药物的副反应。临床上也证明D F O 与D F P 联合用药是一种有效、迅速的去铁方案。研究表明联用两药患者的核磁共振检测心脏的铁沉积显著减少，心脏并发症的发生减少，病死率下降。联合治疗包括同时给药和序贯给药。常用的联合方案：D F O 晚+ D F P 天，或D F 0 3 晚周+ D F P 天，可于1 年内达铁负平衡，降至正常水平；D F P 天+ D F 0 2 次周，稳定铁负荷于较高水平，但不能达到铁负平衡。近期一项评估四种铁螯合剂疗法用于降低地中海贫血患者心脏和肝脏铁浓度的临床观察研究指出，D F O 和D F P 联合治疗能显著降低各种水平的心脏和肝脏铁负荷，而单独使用D F P ，能显著降低轻到中度铁过载，单独使用D F S ，能显著降低肝脏铁浓度。这项研究结果给临床医师用药提供参考，医
