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1、 米曲霉米曲霉筛选与复壮筛选与复壮作业指导书作业指导书 文件编号文件编号: FD: FD- -SOPSOP- -QAQA- -0 02424 受控状态：受控文件 非受控文件 版 本：A/0 发放号： 编制： 审核：质保部 ： 生产部： 工程部： 物流部： 采购部： 生产计划部： 研发部： EHS 部： 人行部： 财务部： 批准： 2012 年 02 月 27 日发布 2012 年 03 月 01 日实施 福达福达( (上海上海) )食品有限公司食品有限公司 文件制订文件制订/ /增删增删/ /修订履历修订履历 修订页次修订页次 修订次修订次 数数 制订制订/ /增删增删/ /修修订 内 容订
2、内 容 制订制订/ /增删增删/ /修修 订订日期日期 修改修改 后版后版 本本 修改人修改人 批准人批准人 文件更文件更 改申请改申请 表表 序号序号 1、 福达（上海）食品有限公司 文件编号：FD-SOP-QA-024 米曲霉筛选与复壮 作业指导书 版本：A/0 生效日期：2012.3.1 第 1 页 共 3 页 1 1 目的目的 根据生产需要，分离筛选出酶活高，孢子数多、活力旺盛、性能稳定的米曲霉菌种，并对其加以保藏。 2 2 适用范围适用范围 本操作程序适用于酱油菌种制备人员。 3 3 职责职责 定期对现使用的米曲霉菌种进行复壮筛选，保持米曲霉的活力不衰退，保藏优良的米曲霉菌种。 4
3、4 工作工序工作工序 4 4.1 .1 作业前准备作业前准备 4.1.1 检查原料试剂（筛选培养基用原料） ，器具（18mm180mm、1.0ml 刻度吸管， 500ml 三角瓶、90mm 培养皿、小玻璃珠、150ml 小烧杯、棉塞、纱布、150150mm 防水纸或牛皮纸、扎绳）是否够用；设备（高压蒸汽灭菌锅、无菌室及超净工作台、烘箱、培养箱）是否可以正常使用。 4.1.2 生理盐水的配制及灭菌 配制一定量的 0.85%的生理盐水，于18mm180mm 试管内各装入 9mL 生理盐水，管口用防水纸封口（共准备试管 6-8 支） 。于带玻璃珠的 300mL 三角瓶内装入 225mL 生理盐水，瓶
4、口封好棉塞并包扎一层牛皮纸（共准备三角瓶 2-3 瓶） 。 4.1.3 将18mm180mm 试管管口塞上棉塞并包扎一层牛皮纸、1.0mL 刻度吸管及90mm 培养皿分别用包扎布包扎好、500mL 三角瓶瓶口用 4 层约 18cm18cm 的正方形纱布及橡皮圈包扎好，外边再用一层牛皮纸包扎。以上所用器具均为经过清洗并凉干的器具。 4.1.4 将以上包扎好的试管、三角瓶生理盐水及各种器具，放入灭菌锅内用 0.1MPa 蒸汽压力灭菌1 小时，待用。 4.2 4.2 初筛初筛 4.2.1 培养基的配方及配制 福达（上海）食品有限公司 文件编号：FD-SOP-QA-024 米曲霉筛选与复壮 作业指导书
5、 版本：A/0 生效日期：2012.3.1 第 2 页 共 3 页 名称 用量（每升） 备注 硝酸钠 3.0g 每升称取 4g 干酪素用0.1mol/L 的氢氧化钠 40ml 水浴加热溶解，定容后调 PH 至6.07.0 氯化钾 0.5g 硫酸镁 0.5g 硫酸亚铁 0.01g 磷酸氢二钾 1.0g 蔗糖 30.0g 琼脂 15.0g 按上述配方称取各类试剂， 然后加入已溶解的干酪素， 定容至 1000ml， 调 PH 至 6.07.0，分装 250ml/瓶，121灭菌 20min，灭菌完成后待培养基冷却至 45左右在超净工作台上倒平板（超净工作台用前经过紫外杀菌 30min） ， 另以上配方
6、可由察氏培养基代替。 4.2.2 孢子悬浮液的制备 在无菌培养箱内，按无菌操作要求。在一支已活化的斜面菌种上，挑取小点米曲霉菌种接入带小玻璃珠的无菌生理盐水三角瓶内，充分振摇 2-5 分钟，将孢子分散，制成悬浮液并在显微镜下检查其孢子数，然后可以定稀释倍数。 4.2.3 菌种的分离及挑选 用一支 1mL 无菌吸管吸取 1mL 悬浮液，注入一支装有 9mL 无菌生理盐水的试管内，将试管摇匀，其稀释度 10-3。再用另一支 1mL 的无菌吸管从该试管中吸取 1ml 稀释液注入第二支装有无菌生理盐水的试管内，摇匀，稀释度为 10- -4 4。如此反复操作，分别做成 10-3、10-4、10-5、10
7、-6、10-7、10-8共 8 个稀释度。从 10-6稀释试管开始，从试管内吸取 0.5mL 稀释液注入平板培养基上,将平板轻轻摇动,使菌液在培养基上分布均匀。每个稀释度做两个平板对照。将平板包扎好，置于 30恒温培养箱培养。 从培养 12 小时开始观察平板生长情况，选取透明圈/菌核的比例大,生长速度快、透明圈大，菌核大的单个菌株， （其透明圈、菌核越大越好） 。一般选取 2-3 个菌株作对照，并将菌株编号。按无菌操作要求，在超净工作台内，将在平板上选中的菌株用无菌接种环挑取一环接种于试管斜面上（每株接种 2 支试管） 。然后将试管置于 30恒温培养箱内，培养 3-4 天。 试管种培养好后，应
8、检查试管斜面的生长情况。试管培养基上应长满黄绿色孢子、菌苔丰厚、福达（上海）食品有限公司 文件编号：FD-SOP-QA-024 米曲霉筛选与复壮 作业指导书 版本：A/0 生效日期：2012.3.1 第 3 页 共 3 页 无杂菌。 4.3 4.3 复筛复筛 4.3.1 三角瓶 按照米曲霉三角瓶菌种制作操作规程内三角瓶菌种制作方法，用筛选的斜面接三角瓶菌种，三角瓶个数视所选菌株的多少而定，每个菌株需做两个平行样。并用母种作对照。培养好后测定其孢子数与发芽率，选择孢子数与发芽率较高的菌株。 4.3.1 小试 用麸皮：水=15g：16.5ml 的比例做小试，每瓶 30g 湿料，按照干料（水分按 5
9、0%）折合 4%0接种量， 每瓶接种 0.06g。共培养 28 小时。下午 12：00 开始培养，次日 8:00 左右摇瓶平铺，16：00 左右收瓶，检测酶活，水份，PH,选择酶活较高的菌株. 4.3.2 发酵验证 用所选的菌株及原菌株一起进行三角瓶发酵产酸试验，每个三角瓶分别称取蒸煮熟豆粕（可取制曲车间蒸煮好的豆粕）70g，小麦粉 15g 置于已灭菌的三角瓶内，混合均匀。在超净工作台内，挑取一环菌种（所选菌株）接种于三角瓶内，适当混匀。然后置于 30恒温培养箱内共培养48 小时。在培养 12-16 小时左右时，如有结块现象，需将结块的培养基摇松。隔 4-6 小时，再摇一次。三角瓶培养 48 小时后，于每瓶内各加入相对密度为 1.156 的盐水（19.5 波美度）87.5mL，再置于 45恒温箱内发酵 5 天。发酵时间到后，取出过滤，测定滤液氨基酸、还原糖等含量。 根据理化测定结果及菌株生长情况等各项指标， 进行综合分析。 从所选菌株中选出最优菌株，选得优良菌株后，可将该菌株转接斜面应用于生产，并采用沙土管保藏法保藏 10 根菌种。 5 5 相关文件相关文件 5.1 FD-SOP-QA-023米曲霉三角瓶菌种制作作业指导 5.2 FD-SOP-QA-018菌种管理规范 6 6 相关记录相关记录 无
