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1、第二章第二章 1. 名词解释 (1)顺反子(cistron):基因所对应的一段核苷酸序列被称为顺反子(cistron) ,一个顺反子 编码一种完整的多肽链。它是遗传的功能单位。 (2)hnRNA:真核基因最初转录生成的 RNA ,是 mRNA 的前体。 (3)转位因子(transposable elements):是指可以从染色体基因组上的位置转移到另一 个位置,甚至在不同的染色体之间跃迁的基因成分。 (4)基因组(genome):细胞中,一套完整单倍体的遗传物质的总合。 (5)启动子(promoter):是 DNA 链上一段能与 RNA 聚合酶结合并能起始转录的序列, 其大小不等,具有转录目
2、标基因的 mRNA 的功能。启动子是基因表达不可缺少的重要元件。(6)基因(gene) ,基因是 DNA 分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列,是遗传物 质的最小功能单位。 (7)顺反子(cistron):基因所对应的一段核苷酸序列被称为顺反子(cistron) ,一个顺反子 编码一种完整的多肽链。它是遗传的功能单位。 (8)终止子(terminator) ,在基因 3端下游外侧与终止密码子相邻的一段非编码的核苷酸 短序列,具有终止转录的功能,叫做终止子(terminator) 。 (9)断裂基因(split gene) ,真核生物的结构基因是不连续的,编码氨基酸的序列被非编 码序列所打断,
3、因而被称为断裂基因(split gene) 。在编码序列之间的序列称为内含子 (intron) ,被分隔开的编码序列称为外显子(exon) 。 (10)顺式作用元件(cis-acting elements) ,指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因 调控蛋白特异性识别和结合的 DNA 序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾 信号和一些反应元件等。 (11)反式作用因子(trans-acting elements) ,可结合顺式作用元件而调节基因转录活性的 蛋白质因子称为反式作用因子(trans-acting elements) 。 (12)上游启动子元件(upstream promo
4、ter elements) ,是 TATA 盒上游的一些特定的 DNA 序列,反式作用因子可与这些元件结合,影响 RNA 聚合酶与启动子的结合及转录起始复 合物的形成,从而调控基因的转录效率。 (13)反应元件(response elements) ,是一类能介导基因对细胞外的某种信号产生反应的 DNA 序列,被称为反应元件(response elements) 。 (14)增强子(enhancer) ,是一段 DNA 序列,其中含有多个能被反式作用因子识别与结 合的顺式作用元件,反应作用因子与这些元件结合后能够调控(通常为增强)邻近基因的 转录。 (15)转位因子(transposable
5、elements):是指可以从染色体基因组上的位置转移到另 一个位置,甚至在不同的染色体之间跃迁的基因成分。 (16)转座子(transposon,Tn) ,是一类较大的可移动成分,它是由几个基因组成的特定 的 DNA 片段,除有关转座的基因外,至少带有一个与转座作用无关并决定宿主性状的基 因(如抗药性基因) 。 (17)假基因(pseudogene) ,假基因是多基因家族中的成员,因其碱基顺序发生某些突变 而失去功能,不能表达或表达异常,生成无生物活性的多肽。 (18)重叠基因(overlapping genes) ,或嵌套基因(nested genes) ,是指基因的核苷酸序列 (或阅读框
6、)是彼此重叠的基因,称为重叠基因或嵌套基因。 (19)基因家族(gene family) ,就是指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性 的一组基因。(20)反向重复序列,是指两个顺序相同的拷贝在 DNA 链上呈反向排列。有两种形式, 一种形式是两个反向排列的拷贝之间隔着一段间隔序列;另一种形式是两个拷贝反向串联 在一起,中间没有间隔序列,这种结构亦称回文结构(palindrome) 。 (21)看家基因(housekeeping gene) ,在几乎所有细胞中或发育过程中持续表达的基因, 被称为看家基因。 (22)锌指(zinc fingers)结构,由约 30 个氨基酸残基组成的一段
7、多肽序列,其中 4 个氨 基酸残基(两个是半脱氨酸两个是组氨酸,或 4 个都是半脱氨酸)以配位键与 Zn2+相互结 合,形成指状结构,常存在于真核转录因子的 DNA 结合结构域中。 (23)亮氨酸拉链(leucine zippers) ,是指在一段肽链中每隔 7 个氨基酸残基就有一个亮氨 酸残基,这段肽链所形成的 -螺旋就会出现一个由亮氨酸残基组成的疏水面,而另一面 则是由亲水性氨基酸残基所构成的亲水面。由亮氨酸残基组成的疏水面即为亮氨酸拉链条, 两个具有亮氨酸拉链条的反式作用因子,能借疏水作用形成二聚体。 (24)基因重排(gene rearangement),是指某些基因片段改变原来存在顺
8、序,通过调整有 关基因片段的衔接顺序,重新组成为一个完整的转录单位。 (25)RNA 编辑(RNA editing) ,是一种较为独特的遗传信息加工的方式,即转录后的 mRNA 在编码区发生核苷酸改变的现象,是在 RNA 分子上出现的一种修饰现象。 (26)分子伴侣(molecular chaperone) ,是指能帮助新生肽链折叠,使之成为成熟蛋白质, 但本身并不参与共价反应的物质,大部分为蛋白质。DNase超敏位点(hypersensitive site):染色体 DNA 中转录较为活跃的区域,组蛋白相 对缺乏,并对核酸酶(DNase)高度敏感,故名。 2. 简述乳糖操纵子中 CAP 的正
9、性调节作用机制。 降解物基因活化蛋白(catabolite gene activation protein,CAP)是一种同二聚体,其分 子内有 DNA 结合区和 cAMP 结合位点。CAP 与 cAMP 结合形成复合物才能刺激操纵子结 构基因的转录。当葡萄糖浓度低时,会使 cAMP 浓度升高,形成 cAMP-CAP 复合物,并与 启动子上游的 CAP 位点结合,刺激 RNA 聚合酶的转录作用,使转录效率提高 50 倍,然 而这种作用的前提条件是无阻遏效应存在。当葡萄糖浓度较高时,cAMP 浓度降低,cAMP 与 CAP 结合受阻,转录效率下降,由此可见,乳糖操纵子结构基因的高表达既需要有诱导
10、 剂的存在(消除阻遏效应) ,又要求无葡萄糖或低浓度葡萄糖的条件(促进 cAMP-CAP 复 合物的形成,刺激转录) 。 3. 比较原核基因组与真核基因组的结构与功能特点1 原核生物基因组仅由一条环状双链 DNA 分子组成,含有 1 个复制起点,无染色体结 构,基因的转录和翻译在同一区域进行。1多条染色体,两份同源的基因组,而原 核生物的基因组则是单拷贝的。基因组庞大、 复杂,具有许多复制起点,每个复制子大小 不一。2具有操纵子结构 这是原核基因组的一个突出的结构特点。2. 无明显操纵子结构,存在大量反式作用因 子与顺式作用元件的相互作用调节3编码序列在基因组中约占 50% 编码顺序不重叠,其
11、转录产物多为多顺反子 结构。3非编码的顺序占绝大部分,约占 90%以 上。基因组中非编码的顺序所占比例是真核 生物与细菌、病毒的重要区别。4多顺反子结构,无内含子,是连续的, 因此转录后不需要剪切。4单顺反子结构,即一分子 mRNA 只能翻 译成一种蛋白质。存在断裂基因。5基因组中重复序列很少5含有大量重复顺序,这是真核生物基因 组的重要特点。6存在移动基因,包括插入序列和转座子6 有基因家族,功能相关的基因构成各种基因家族,它们可串联在一起,亦可相距很远。4. 简述真核表达调控的主要环节和调控方式。 (一)DNA 水平的调控:(1) 染色质结构对基因表达的调控作用, (2)基因修饰, (3)
12、 基因重排, (4)基因扩增。 (二)转录水平的调控(转录起始的调控) (1)反式作用因子的活性调节;(2)反式作用因子与顺式元件的结合;(3)反式作 用因子的组合式调控作用 (三)转录后水平调控 (1) “加帽”和“加尾”的调控;(2)mRNA 选择性剪接对表达的调控 ;(3) RNA 编辑的调控;(4)mRNA 转运调节 (四)翻译水平的调控 (1)翻译起始调控;(2)mRNA 稳定性对翻译的影响 (五)翻译后水平的调控 (1)信号肽的切除;(2)新生肽链的修饰;(3) 肽链的剪接与正确折叠第三章第三章 1. 核酸分离纯化应注意哪些事项?一般的分离纯化分为哪些步骤?各步的要点是什么? 分离
13、纯化核酸应注意:应保证核酸一级结构的完整性,防止降解;排除其它分子 的污染。为了保证核酸结构与功能的研究,完整的一级结构是最基本的要求,因为遗传信 息全部贮存在一级结构之内。保持核酸的完整性,即保持其天然状态。细胞内的核酸酶活 力很高,在制取过程中必须防止核酸酶对核酸的降解。防止化学因素(酸碱等)和物理因 素(高温或机械剪切等)引起核酸变性或破坏。制备 RNA 要特别注意防止核酸酶的作用,因 为 RNase 分布很广,活力很高;而对 DNA 更重要的是防止张力剪切作用,因为 DNA 分子 特别长,容易断裂。核酸的纯化:首先是去除蛋白质。要点:从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化 核酸,要先用某
14、些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后,再用有机溶剂抽提。从核酸溶液中去 除蛋白质常用酚/氯仿抽提法,在氯仿中加入少许异戊醇的目的在于减少蛋白质变性操作过 程中产生的气泡。用氯仿抽提处理,去除核酸溶液中的痕量酚。要点:如果下一步骤中 酶反应的条件要求严格,最可靠的方法是再用水饱和的乙醚抽提一次,以彻底去除核酸样 品中的痕量酚与氯仿,然后在 68水浴中放置 10 分钟使痕量乙醚蒸发掉。 2. 质粒纯化可采用什么方法?简述各方法基本原理。 质粒 DNA 分离方法有碱裂解法、煮沸法、去污剂(Triton/SDS)裂解法、CsCl- EB(氯化铯-溴乙锭)密度梯度平衡离心法、羟基磷灰石柱层析法、质粒 DNA
15、释放法及商 业化的试剂盒等。 碱裂解法基本原理:利用质粒较小且为超螺旋共价闭合环状分子的特点,它与染色 体 DNA 在拓扑学上有很大差异来分离。即在碱性 pH(12-12.5)下,DNA 分子均变性, 恢复中性时,线性染色体 DNA 由于两条链分开且基因组分子量大,单链互相无规则缠绕, 不能准确复性,就与其他成分共沉淀,而质粒 DNA 分子小且两条闭合环状分子及时变性 也较紧密的缠绕在一起,准确复性而留于上清溶液中。 煮沸法:利用加热处理 DNA 溶液时,线状染色体 DNA 容易发生变性,共价闭环的 质粒 DNA 在冷却时即恢复其天然构象,变性染色体 DNA 片段与变性蛋白质和细胞碎片结 合形
16、成沉淀,而复性的超螺旋质粒 DNA 分子则以溶解状态存在液相中,通过高速离心 (12,000 g)将两者分开。然后可用 5%CTAB 选择性沉淀 DNA,进一步用乙醇洗涤、沉淀,保存于 TE 缓冲液中。 CsCl-EB(氯化铯-溴乙锭)密度梯度平衡离心法:CsCl 是一种大分子量的重金属盐, 长时间超速离心时,在管中形成 11.8052g/cm3自上而下增加的密度梯度。含有细胞裂解 液的体系在长时间超速离心平衡后,DNA 的沉降速度与扩散速度达到平衡,染色体 DNA、质粒、RNA 以及蛋白质等,不同浮力密度的物质可在管内不同位置形成区带。 RNA 可与 Cs+结合,因此密度最大,沉积管底,蛋白质漂浮于液面上。溴乙锭(EB)是一 种荧光染料,能够插入 DNA 分子的碱基平面之间,使螺旋松弛,增加浮力密度,同时与 核酸分子结合后,在紫外光激发下发出橙色荧光,可以显示 DNA 区带所处的位置。染色 体 DNA 和质粒 DNA 的浮力密度均为 1.70g/cm3,区别不大,但 EB 易插入线性 DNA 分子 中,从而增大了与闭合环状 DN