基因工程思考题答案

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1、第二章第二章 1. 名词解释 （1）顺反子(cistron)：基因所对应的一段核苷酸序列被称为顺反子（cistron） ，一个顺反子 编码一种完整的多肽链。它是遗传的功能单位。 （2）hnRNA：真核基因最初转录生成的 RNA ，是 mRNA 的前体。 （3）转位因子（transposable elements）：是指可以从染色体基因组上的位置转移到另一 个位置，甚至在不同的染色体之间跃迁的基因成分。 （4）基因组（genome）：细胞中，一套完整单倍体的遗传物质的总合。 （5）启动子（promoter）：是 DNA 链上一段能与 RNA 聚合酶结合并能起始转录的序列， 其大小不等，具有转录目

2、标基因的 mRNA 的功能。启动子是基因表达不可缺少的重要元件。（6）基因（gene） ，基因是 DNA 分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物 质的最小功能单位。 （7）顺反子(cistron)：基因所对应的一段核苷酸序列被称为顺反子（cistron） ，一个顺反子 编码一种完整的多肽链。它是遗传的功能单位。 （8）终止子（terminator） ，在基因 3端下游外侧与终止密码子相邻的一段非编码的核苷酸 短序列，具有终止转录的功能，叫做终止子（terminator） 。 （9）断裂基因（split gene） ，真核生物的结构基因是不连续的，编码氨基酸的序列被非编 码序列所打断，

3、因而被称为断裂基因（split gene） 。在编码序列之间的序列称为内含子 （intron） ，被分隔开的编码序列称为外显子（exon） 。 （10）顺式作用元件（cis-acting elements） ，指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因 调控蛋白特异性识别和结合的 DNA 序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾 信号和一些反应元件等。 （11）反式作用因子（trans-acting elements） ，可结合顺式作用元件而调节基因转录活性的 蛋白质因子称为反式作用因子（trans-acting elements） 。 （12）上游启动子元件（upstream promo

4、ter elements） ，是 TATA 盒上游的一些特定的 DNA 序列，反式作用因子可与这些元件结合，影响 RNA 聚合酶与启动子的结合及转录起始复 合物的形成，从而调控基因的转录效率。 （13）反应元件（response elements） ，是一类能介导基因对细胞外的某种信号产生反应的 DNA 序列，被称为反应元件（response elements） 。 （14）增强子（enhancer） ，是一段 DNA 序列，其中含有多个能被反式作用因子识别与结 合的顺式作用元件，反应作用因子与这些元件结合后能够调控（通常为增强）邻近基因的 转录。 （15）转位因子（transposable

5、elements）：是指可以从染色体基因组上的位置转移到另 一个位置，甚至在不同的染色体之间跃迁的基因成分。 （16）转座子（transposon，Tn） ，是一类较大的可移动成分，它是由几个基因组成的特定 的 DNA 片段，除有关转座的基因外，至少带有一个与转座作用无关并决定宿主性状的基 因（如抗药性基因） 。 （17）假基因（pseudogene） ，假基因是多基因家族中的成员，因其碱基顺序发生某些突变 而失去功能，不能表达或表达异常，生成无生物活性的多肽。 （18）重叠基因（overlapping genes） ，或嵌套基因（nested genes） ，是指基因的核苷酸序列 （或阅读框

6、）是彼此重叠的基因，称为重叠基因或嵌套基因。 （19）基因家族（gene family） ，就是指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性 的一组基因。（20）反向重复序列，是指两个顺序相同的拷贝在 DNA 链上呈反向排列。有两种形式， 一种形式是两个反向排列的拷贝之间隔着一段间隔序列；另一种形式是两个拷贝反向串联 在一起，中间没有间隔序列，这种结构亦称回文结构（palindrome） 。 （21）看家基因（housekeeping gene） ，在几乎所有细胞中或发育过程中持续表达的基因， 被称为看家基因。 （22）锌指（zinc fingers）结构，由约 30 个氨基酸残基组成的一段

7、多肽序列，其中 4 个氨 基酸残基（两个是半脱氨酸两个是组氨酸，或 4 个都是半脱氨酸）以配位键与 Zn2+相互结 合，形成指状结构，常存在于真核转录因子的 DNA 结合结构域中。 （23）亮氨酸拉链（leucine zippers） ，是指在一段肽链中每隔 7 个氨基酸残基就有一个亮氨 酸残基，这段肽链所形成的 -螺旋就会出现一个由亮氨酸残基组成的疏水面，而另一面 则是由亲水性氨基酸残基所构成的亲水面。由亮氨酸残基组成的疏水面即为亮氨酸拉链条， 两个具有亮氨酸拉链条的反式作用因子，能借疏水作用形成二聚体。 （24）基因重排（gene rearangement)，是指某些基因片段改变原来存在顺

8、序，通过调整有 关基因片段的衔接顺序，重新组成为一个完整的转录单位。 （25）RNA 编辑（RNA editing） ，是一种较为独特的遗传信息加工的方式，即转录后的 mRNA 在编码区发生核苷酸改变的现象，是在 RNA 分子上出现的一种修饰现象。 （26）分子伴侣（molecular chaperone） ，是指能帮助新生肽链折叠，使之成为成熟蛋白质， 但本身并不参与共价反应的物质，大部分为蛋白质。DNase超敏位点（hypersensitive site）：染色体 DNA 中转录较为活跃的区域，组蛋白相 对缺乏，并对核酸酶（DNase）高度敏感，故名。 2. 简述乳糖操纵子中 CAP 的正

9、性调节作用机制。 降解物基因活化蛋白（catabolite gene activation protein，CAP）是一种同二聚体，其分 子内有 DNA 结合区和 cAMP 结合位点。CAP 与 cAMP 结合形成复合物才能刺激操纵子结 构基因的转录。当葡萄糖浓度低时，会使 cAMP 浓度升高，形成 cAMP-CAP 复合物，并与 启动子上游的 CAP 位点结合，刺激 RNA 聚合酶的转录作用，使转录效率提高 50 倍，然 而这种作用的前提条件是无阻遏效应存在。当葡萄糖浓度较高时，cAMP 浓度降低，cAMP 与 CAP 结合受阻，转录效率下降，由此可见，乳糖操纵子结构基因的高表达既需要有诱导

10、 剂的存在（消除阻遏效应） ，又要求无葡萄糖或低浓度葡萄糖的条件（促进 cAMP-CAP 复 合物的形成，刺激转录） 。 3. 比较原核基因组与真核基因组的结构与功能特点1 原核生物基因组仅由一条环状双链 DNA 分子组成，含有 1 个复制起点，无染色体结 构，基因的转录和翻译在同一区域进行。1多条染色体，两份同源的基因组，而原 核生物的基因组则是单拷贝的。基因组庞大、 复杂，具有许多复制起点，每个复制子大小 不一。2具有操纵子结构 这是原核基因组的一个突出的结构特点。2. 无明显操纵子结构，存在大量反式作用因 子与顺式作用元件的相互作用调节3编码序列在基因组中约占 50% 编码顺序不重叠，其

11、转录产物多为多顺反子 结构。3非编码的顺序占绝大部分，约占 90%以 上。基因组中非编码的顺序所占比例是真核 生物与细菌、病毒的重要区别。4多顺反子结构，无内含子，是连续的， 因此转录后不需要剪切。4单顺反子结构，即一分子 mRNA 只能翻 译成一种蛋白质。存在断裂基因。5基因组中重复序列很少5含有大量重复顺序，这是真核生物基因 组的重要特点。6存在移动基因，包括插入序列和转座子6 有基因家族，功能相关的基因构成各种基因家族，它们可串联在一起，亦可相距很远。4. 简述真核表达调控的主要环节和调控方式。 （一）DNA 水平的调控：（1） 染色质结构对基因表达的调控作用， （2）基因修饰， （3）

12、 基因重排， （4）基因扩增。 （二）转录水平的调控（转录起始的调控） （1）反式作用因子的活性调节；（2）反式作用因子与顺式元件的结合；（3）反式作 用因子的组合式调控作用 （三）转录后水平调控 （1） “加帽”和“加尾”的调控；（2）mRNA 选择性剪接对表达的调控 ；（3） RNA 编辑的调控；（4）mRNA 转运调节 （四）翻译水平的调控 （1）翻译起始调控；（2）mRNA 稳定性对翻译的影响 （五）翻译后水平的调控 （1）信号肽的切除；（2）新生肽链的修饰；(3) 肽链的剪接与正确折叠第三章第三章 1. 核酸分离纯化应注意哪些事项？一般的分离纯化分为哪些步骤？各步的要点是什么？ 分离

13、纯化核酸应注意：应保证核酸一级结构的完整性，防止降解；排除其它分子 的污染。为了保证核酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗传信 息全部贮存在一级结构之内。保持核酸的完整性，即保持其天然状态。细胞内的核酸酶活 力很高，在制取过程中必须防止核酸酶对核酸的降解。防止化学因素(酸碱等)和物理因 素(高温或机械剪切等)引起核酸变性或破坏。制备 RNA 要特别注意防止核酸酶的作用，因 为 RNase 分布很广，活力很高；而对 DNA 更重要的是防止张力剪切作用，因为 DNA 分子 特别长，容易断裂。核酸的纯化：首先是去除蛋白质。要点：从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化 核酸，要先用某

14、些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后，再用有机溶剂抽提。从核酸溶液中去 除蛋白质常用酚/氯仿抽提法，在氯仿中加入少许异戊醇的目的在于减少蛋白质变性操作过 程中产生的气泡。用氯仿抽提处理，去除核酸溶液中的痕量酚。要点：如果下一步骤中 酶反应的条件要求严格，最可靠的方法是再用水饱和的乙醚抽提一次，以彻底去除核酸样 品中的痕量酚与氯仿，然后在 68水浴中放置 10 分钟使痕量乙醚蒸发掉。 2. 质粒纯化可采用什么方法？简述各方法基本原理。 质粒 DNA 分离方法有碱裂解法、煮沸法、去污剂（Triton/SDS）裂解法、CsCl- EB（氯化铯-溴乙锭）密度梯度平衡离心法、羟基磷灰石柱层析法、质粒 DNA

15、释放法及商 业化的试剂盒等。 碱裂解法基本原理：利用质粒较小且为超螺旋共价闭合环状分子的特点，它与染色 体 DNA 在拓扑学上有很大差异来分离。即在碱性 pH（12-12.5）下，DNA 分子均变性， 恢复中性时，线性染色体 DNA 由于两条链分开且基因组分子量大，单链互相无规则缠绕， 不能准确复性，就与其他成分共沉淀，而质粒 DNA 分子小且两条闭合环状分子及时变性 也较紧密的缠绕在一起，准确复性而留于上清溶液中。 煮沸法：利用加热处理 DNA 溶液时，线状染色体 DNA 容易发生变性，共价闭环的 质粒 DNA 在冷却时即恢复其天然构象，变性染色体 DNA 片段与变性蛋白质和细胞碎片结 合形

16、成沉淀，而复性的超螺旋质粒 DNA 分子则以溶解状态存在液相中，通过高速离心 （12,000 g）将两者分开。然后可用 5%CTAB 选择性沉淀 DNA，进一步用乙醇洗涤、沉淀，保存于 TE 缓冲液中。 CsCl-EB（氯化铯-溴乙锭）密度梯度平衡离心法：CsCl 是一种大分子量的重金属盐， 长时间超速离心时，在管中形成 11.8052g/cm3自上而下增加的密度梯度。含有细胞裂解 液的体系在长时间超速离心平衡后，DNA 的沉降速度与扩散速度达到平衡，染色体 DNA、质粒、RNA 以及蛋白质等，不同浮力密度的物质可在管内不同位置形成区带。 RNA 可与 Cs+结合，因此密度最大，沉积管底，蛋白质漂浮于液面上。溴乙锭（EB）是一 种荧光染料，能够插入 DNA 分子的碱基平面之间，使螺旋松弛，增加浮力密度，同时与 核酸分子结合后，在紫外光激发下发出橙色荧光，可以显示 DNA 区带所处的位置。染色 体 DNA 和质粒 DNA 的浮力密度均为 1.70g/cm3，区别不大，但 EB 易插入线性 DNA 分子 中，从而增大了与闭合环状 DN