《骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠酒精性痴呆及机制》由会员分享，可在线阅读，更多相关《骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠酒精性痴呆及机制（58页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、学位论文独创性声明学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名( 手写) ：笨峨签字日期：矽、5 年学位论文版权使用授权书日本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分
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3、 c h y m a lS t e mC e l l s ，B M M S C s ) 移植治疗大鼠酒精性痴呆( a l c o h 0 1 a s s o c i a t e dd e m e n t i a ，A A D ) 的疗效及其机制。方法：1 、以S D 大鼠为研究对象，按数字随机方法分为：2 0 酒精( 4 m l k g d ) 灌胃2 8 d 组：2 0 酒精( 4 m l k g d ) 腹腔注射2 8 d 组；2 0 酒精( 4 m l k g d ) 灌胃14 d组；2 0 酒精( 8 m l k g d ) 灌胃14 d 组；2 0 酒精( 12 m l k g d
4、) 灌胃14 d 组；生理盐水( 4 m l k g d ) 灌胃2 8 d 对照组；生理盐水( 4 n 舭e g d ) 腹腔注射2 8 d 对照组；生理盐水( 4 m l k g d ) 灌胃1 4 d 。探索建立A A D 大鼠模型最佳条件。2 、M o r r i s 水迷宫行为学检测逃避潜伏期( E s c a p eL a t e n c y ，E L ) ，以测定大鼠痴呆程度。3 、H E 组织化学染色检测酒精性痴呆大鼠海马齿状回脑组织损伤形态学变化。4 、H o e c h s t 荧光染色观察、计数酒精性痴呆大鼠海马齿状回凋亡神经细胞。5 、直接贴壁法分离、培养、纯化和扩增B
5、 M M S C s 。6 、流式细胞仪鉴定B M M S C s 表面抗原C D 9 0 、C D 2 9 、C D 3 4 、C D 4 5 。7 、选择最适合的A A D 大鼠模型建立方法 ( 2 0 酒精( 4m l k g d ) 灌胃2 8 d ，同时设立生理盐水对照组评估模型。A A D 模型建立1 周后采用静脉或立体定向移植途径移植3xl0 6B M M S C s 或P B S ，M o r r i s 水迷宫行为学检测B M M S C s 移植后E L 改变。8 、各组大鼠脑组织H E 、H o e c h s t 3 3 3 4 2 染色观察、计数B M M S C s
6、 静脉移植或立体定向移植后脑组织海马齿状回形态和凋亡神经细胞数的变化。9 、免疫组织化学检测大鼠海马齿状回、C A l 区、C A 3 各区B D N F 的表达。1 0 、采用比色法检测大鼠血清T - S O D 和G S H P X 活力。摘要结果：l 、与相应生理盐水对照组相比，2 0 酒精( 4 m l k g d ) 灌胃1 4 d 或2 8 d 组均可诱导大鼠学习记忆功能明显损害，大鼠E L 均显著延长( 尸 0 0 5 ) 。4 、B M M S C s 贴壁生长，形态呈梭形，流式细胞仪鉴定高表达C D 2 9 ( 9 8 6 )和C D 9 0 ( 8 0 4 ) ，低表达C
7、D 3 4 ( O 1 ) 和C D 4 5 ( 5 8 ) 。5 、与生理盐水对照组相比，选择2 0 酒精( 4 m l k g d ) 灌胃2 8 d 成功建立A A D模型，A A D 模型组大鼠E L 显著延长( 尸 3 0 s ) 。2 2 3 4 行为学检测所有实验动物建模后每次行M W M 行为学检测时均需变换平台象限位置，均如上行M W M 行为学训练5 天，并且于第6 天任选一入水点轻放入水测得的E L 值作为视空间定向学习记忆行为功能的评估参数。第2 章材料与方法2 2 44 多聚甲醛灌注( 1 ) 各组大鼠于实验结束后称取其体重，按0 3 m l 1 0 0 9 的规格腹
8、腔注射1 0 水合氯醛麻醉。( 2 ) 将大鼠的胸腹腔剪开，夹闭腹主动脉，充分暴露心脏，用注射器抽取5 m l 抗凝血，并于右心处剪一横行切口。( 3 ) 将5 0 0 m l 生理盐水从心尖出缓慢滴入心脏，以置换出大鼠的血液。( 4 ) 当大鼠上肢及头部颜色呈苍白色时，用4 多聚甲醛取代生理盐水继续从心尖处缓慢滴入心脏。( 5 ) 当大鼠上肢及头部变得僵硬，停止灌注，取出大脑，置于4 多聚甲醛中继续固定4 8 h 。( 6 ) 用脑槽沿冠状轴将脑组织切成连续的7 块，厚均为2 m m ，取第2 4 块脑片再脱水、透明、浸蜡、最后包埋成蜡块。2 2 5 脑组织H E 染色上述各组大鼠取第3 个
9、蜡块每隔5 4 p , m 切取各2 张厚为6 p , m 切片分别行H E染色，观察海马组织病理形态改变。( 1 ) 脱蜡：二甲苯I 一1 5 m i n ，二甲苯I I 一1 0m i n ，二甲苯I I I 一2m i n 。( 2 ) 水化：无水酒精一2m i n ，9 5 酒精一2m i n ，8 0 酒精一2m i n 。( 3 ) 自来水洗片刻，蒸馏水片刻。( 4 ) 苏木素液染核5 m i n 。( 5 ) 自来水洗片。( 6 ) 盐酸酒精分化O 5 m i n 。( 7 ) 流水冲洗片刻。( 8 ) 弱氨水水溶液反蓝l m i n 。( 9 ) 流水冲洗1 5 m i n 。
10、( 1 0 ) O 5 伊红水溶液复染( 对比染色) 7 m i n 。( 1 1 ) 自来水洗( 分化伊红) 片刻。( 1 2 ) 脱水：9 5 酒精I - - 2 m i n ，9 5 酒精I I 一2 m i n ，无水酒精I - - 2 m i n ，无水酒精I I 一2 m i n 。( 1 3 ) 透明：二甲苯I - - 5 m i n ，二甲苯I I 一5 m i n 。7第2 章材料与方法( 1 4 ) 中性树胶封片，镜下观察。胞核呈蓝色，胞浆呈红色。2 2 6 脑组织H o e c h s t 3 3 3 4 2 染色上述各组大鼠脑组织蜡块每隔5 4 1 舡m 切取各2 张厚
11、为6 岬的切片。H o e c h s t 3 3 3 4 2 染色观察和计数凋亡海马神经细胞。( 1 ) 脱蜡：二甲苯I 一1 5 m i n ，二甲苯I I 一1 0m i n ，二甲苯I I I 一2m i n 。( 2 ) 水化：无水酒精2m i n ，9 5 酒精一2m i n ，8 0 酒精一2m i n 。( 3 ) 自来水洗片刻，蒸馏水片刻。( 4 ) 每张切片滴加l O O g lH o e c h s t 3 3 3 4 2 染色液避光染色1 0 1 5 m i n 。( 5 ) P B S 漂洗5 m i n x 3 次。( 6 ) 甘油封片，荧光显微镜下观察拍照。上述H
12、 o e c h s t 3 3 3 4 2 染色均重复做2 张切片每只大鼠，在大鼠两侧海马D G l 3视野( 见F i g u r e l ) ，荧光显微镜在2 0 X 物镜下拍照和计数凋亡神经细胞。正常细胞核的H o e c h s t 着色形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶、碎片状、边集。2 2 7A A D 模型大鼠B M M N C s 移植分组A A D 模型大鼠B M M N C s 移植分组见表2 ：表2 实验动物分组生理盐水模型对照组( C o n t r o l ，C o n )酒精模型组( E t h a n o l ，
13、E t h )P B S 静脉移植组( V e i n P B S ，V - P B S )B M M S C s 静脉移植组( V e i n C e l l ，V - C e l )P B S 立体定向移植组( S t e r e o t a c t i c P B S ，S - P B S )B M M S C s 立体定向移植组( S t e r e o t a c t i c C e l l ，S - C e l )776661 0E t h 组、V - P B S 组、V - C e l 组、S - P B S 组和S - C e l 组大鼠每天通过灌胃途径给予4 m l k g
14、酒精一次，C o n 组大鼠给予同等剂量生理盐水，连续作用2 8 天建立A A D 模型后再如上行M W M 行为学检测大鼠视空间定向行为功能改变，再分别第2 章材料与方法通过静脉移植或立体定向移植途径移植B M M S C s 或P B S 。2 2 8 全骨髓贴壁法分离和扩增B I 啊M S 0 s( 1 ) 取2 4 周龄的S D 乳鼠( 清洁级雄性S D 大鼠2 4 周龄，江西省中医学院) 脱臼处死，用7 5 酒精浸泡3 m i n 消毒。( 2 ) 将S D 乳鼠固定于无菌操作台上。( 3 ) 用剪刀、镊子游离乳鼠双后肢的股骨和胫骨，彻底剔除软组织，再将两端骨骺减去，暴露骨髓腔。(
15、4 ) 用5 m l 注射器抽取培养基( 含1 0 F B S 的D M E M F 1 2 ) 反复冲洗骨髓腔于无菌1 5 m l 小烧杯内，轻轻出大混匀。( 5 ) 收集冲洗液直接接种于2 5 c m 2 的培养瓶中，置于5 C 0 2 ，3 7 。C 恒温孵育箱中孵育。( 6 ) 2 4 h 后半量换液，以后根据细胞营养状况和细胞液颜色判断3 5 d 换液一次。( 7 ) 原代培养8 9 d 细胞融合率达8 0 9 0 ，用0 2 5 胰酶消化液( 含0 0 1 E D T A ) l m l 消化1 - 2 m i n ，再加入含1 0 F B S 的D M E M F 1 2 ( 1
16、 ：1 ) 培养基2 m l 终止消化。( 8 ) 反复吹打细胞成悬液，用P B S 洗涤3 次( 1 0 0 0 r m i n 、离心5 m i n ) 。( 9 ) 再接种于新的2 5 c m 2 培养瓶，置于3 7 。C ，5 C 0 2 的孵育箱中。2 2 9B M M S 0 s 的鉴定( 1 ) 取第三代的B M M S C s 用0 2 5 胰酶消化液( 含0 0 1 E D T A ) 消化液消化1 - 2 m i n 和培养基( 含1 0 F B S 的D M E M F 1 2 ) 终止消化。( 2 ) 用冷P B S 洗涤3 次( 1 0 0 0r m i n 、离心5m i n ) 。( 3 ) 用计数板计数，用P B S 调整细胞密度为1 0 6 个m l 。( 4 ) 用微量泵吸取上述细胞
