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1、甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用1季宇彬1,2，冯小燕1,2，高世勇1,2（1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心药物研究所博士后科研工作站，哈尔滨 150076；2.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨 150076）摘要摘要：研究甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用。应用 MTT 法观察体外甜菜碱在不同浓度、不同时间对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，应用流式细胞仪（FCM）测小鼠脾淋巴细胞在不同时间周期的变化。结果表明：甜菜碱终浓度0.4mM、4mM、20mM 均可促淋巴细胞增值，但终浓度 4mM 效果最为明显，在甜菜碱刺激 24h、48h、72h 后，淋巴细胞均可显著增值，但随时间的
2、加倍，增值幅度并不明显，综合考虑，24h 效果更好。终浓度 4mM 甜菜碱不同时间均可促进淋巴细胞由 G0/G1期进入 S 期，且作用 18h 效果最明显，其 G0/G1期由97.03%下降到 89.99%，S 期由 2.58%升高到 9.08%。到 24h 后，其诱导作用反而有些下降。因此，甜菜碱 4mM 作用 24h 促淋巴细胞增殖最为理想。4mM 的甜菜碱 18h 促进淋巴细胞由 G0/G1期进入 S 期的作用效果最好。关键词：关键词：甜菜碱；淋巴细胞增殖；细胞周期 Effects of Betaine on Mouse Splen-lymphocytes in VitroJI yu-b
3、in1,2, FENG xiao-yan1,2, GAO shi-yong1,2 (1. Center of Research and Development on Life Sciences and Environmental Sciences, Harbin University of Commerce. Harbin 150076, China. 2. Engineering Research Center of Natural Anticancer Drugs, Ministry of Education. Harbin 150076, China)Abstract: To inves
4、tigate the effects of Betaine on splen-lymphocytes proliferation, To observe the effects of the Betaine on the lymphocyte proliferation of mouse by MTT at different concentrations and times. To observe the effects of the Betaine on the lymphocyte proliferation cell-cycle of mouse by FCM. The result
5、indicate that Betaine can stimulate lymphocytes proliferation at the concentrations of 0.4mM、4mM and 20mM, but 4mM is the best; Betaine can stimulate lymphocytes proliferation at the time of 24h、48h and 72h, but 24h is the best. Betaine can change the cell-cycle 基金项目：国家自然科学基金项目（30400352） ；教育部重点项目（20
6、5045） ；黑龙江省自然科学基金 （D200611） ；黑龙江省研究生创新基金（YJSCX2006-0077HSD） 作者简介：季宇彬(1956-)，男，教授，博士生导师，研究方向为肿瘤药理学的研究。distribution of lymphocytes at different times, and the best time of increasing the proportion of S-phase cells is 18h , raising from 2.58% to 9.08%. So, betaine can stimulate lymphocytes proliferati
7、on and the best concentrations is 4mM, the best time is 24h. Betaine can increasing the proportion of S-phase cells, 18h is the best.Key words: Betaine；Lymphocytes proliferation；cell-cycle； 甜菜碱是一种季氨型生物碱，又名甘氨酸甜菜碱、三甲基甘氨酸等1，化学名称为 N-N-N-三甲基甘氨酸内盐2，结构简式（CN3）3N+CH2COO-，其化学结构与氨基酸、胆碱相似3。甜菜碱本身是动物体内的代谢中间产物，经大量
8、试验证明，甜菜碱及其盐类无毒、无害、无污染4，其小鼠半数致死量（LD50）在 11000mg/kg，对动物无致畸、致癌、致突变作用，是公认的安全物质5，且能促进脂肪代谢，促进蛋白质的合成6。淋巴细胞（lymphocyte）是免疫系统中较重要的细胞，在免疫应答中起关键作用7，有关报道指出甜菜碱有增强机体免疫的作用。本文研究了甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用及对细胞周期的影响。1 试验材料1.1 实验仪器CO2培养箱（日本三洋公司） ；流式细胞仪（美国 Backman-Coulter 公司） ；Olympus IX70 倒置显微镜（Olympus 公司） ；电子天平（Ohaus 公司） ；Bio-
9、680型酶标仪（美国 Bio-Rad 公司） ；Gilson 移液器（France）1.3 实验药品与主要试剂甜菜碱（浙江绿成生物技术有限公司） ；ConA （Sigma 公司） ；MTT（Sigma 公司） ；胎牛血清（Hyclone 公司） ；RPMI-1640（Gibco 公司） ；核糖核酸酶（Sigma 公司） ；PI（Sigma 公司）1.3 实验动物BALB/c 小鼠：兼用，体重(202.0)，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供，2 试验方法 2.1 小鼠脾淋巴细胞分离以颈椎脱臼法处死小鼠，用 75乙醇浸泡小鼠 15min，沿腹腔中线剪开小鼠胸腔，取出脾脏置于培养皿中，剪去脂肪和
10、筋膜组织，用 RPMI1640 培养液漂洗，用注射器芯轻轻挤压，用 200 目尼龙网过滤到玻璃离心管中，无菌PBS，1500 rpm 离心 5 min 洗涤细胞两次，加入 0.83的氯化胺到洗过的细胞中，静置 5min,以除去血红细胞，用 RPMI1640 培养液离心洗涤细胞两次，以除去剩余的氯化胺，将上述收集到的脾脏细胞置于玻璃培养瓶中，在 37，5% CO2培养箱中静止培养 24h，以除去贴壁细胞，收集未贴壁的细胞悬液即获得脾淋巴细胞。计数接种培养，台盼蓝染色计数，活细胞数大于 95。2.2甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响（1）甜菜碱最佳浓度的考察：取小鼠脾淋巴细胞，调整细胞浓度为1.51
11、06个ml，100L/孔加入 96 孔细胞培养板,每孔加入 100L 不同浓度的甜菜碱，甜菜碱的最终浓度分别为 0.04mM、0.4mM、4mM、20mM，同时加入促细胞有丝分裂原刀豆球蛋白（ConA） ，终浓度为 0.110-3mM。设空白对照孔（不加任何药物，只有细胞和培养液） ，同时设无细胞对照，以排除假阳性。每一浓度 6 个复孔。 置于 37、5%CO2的饱和水蒸汽培养箱中培养 72h 后，每孔加 22L 新鲜配制的 12mM 的 MTT，继续培养 4h，轻轻吸取培养液上清150L，每孔加 150L DMSO 溶解 MTT 甲簪沉淀，用微型振荡器振荡混匀，用酶标仪于 570nm 波长读
12、取各孔光密度值。 （2）最佳时间的考察：方法同上，只是将甜菜碱浓度定为上述实验筛选出的最佳浓度，培养时间为12h、24h、48h、72h。2.3 甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞周期分布的影响取小鼠脾淋巴细胞，调整细胞浓度为 1.5107个ml，以 1ml/孔加入 24 孔培养板，加入甜菜碱使其终浓度为 4mM，设 RPMI-1640 培养基为阴性对照组。于 4h、6h、18h、24h 收集细胞。1500 转离心 15min，细胞沉淀用 70%乙醇悬浮，在 4冰箱固定 12 小时以上。固定后的细胞用 PBS 洗两遍并悬浮，加入0.8ml PI 染液（生理盐水 32.4ml；核糖核酸酶 0.5mg；Tri
13、ton-x-100 0.25ml；PI 2.5mg；枸橼酸钠 50mg，加蒸馏水至 50ml，4避光保存） ，摇均匀后于 4，避光放置 1 小时，经 300 目尼龙网过滤，在流式细胞仪上计数 10,000 个细胞，分别测定各个时间段各期细胞含量，分析细胞周期。每组均重复三次。2.5 统计分析用 SPSS13.0 软件对实验数据进行方差分析。3 实验结果 3.1 甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响对甜菜碱不同浓度分析表明，甜菜碱终浓度 0.4mM、4mM、20mM 均可促淋巴细胞增值，但终浓度 4mM 效果最为明显。对甜菜碱不同时间分析表明，在甜菜碱刺激 24h、48h、72h 后，淋巴细胞均可显
14、著增值，但随时间的加倍，增值幅度并不明显，综合考虑，24h 效果更好。因此甜菜碱 4mM 作用 24h 促淋巴细胞增殖最为理想。Table 1 Influence of Betaine on mouse splen- lymphocytes at different concentration（ ，n=6）xGroupDose(mM)OD value ControlConABetaine 0.110-30.040.44200.250.010.390.01*0.290.01*0.350.02*0.370.01*0.360.01*p0.05 vs control , *p0.01 vs contr
15、ol Table 2 Influence of Betaine on mouse splen- lymphocytes at different times（ ，n=6）xTimesOD value Control ConA Betaine12h24h48h72h0.260.01 0.310.02* 0.280.01* 0.250.01 0.370.01* 0.350.01* 0.250.01 0.380.01* 0.360.01*0.250.01 0.390.01* 0.380.01*p0.05 vs control , *p0.01 vs control3.2 甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞周期分布的影响由不同时间点淋巴细胞周期与甜菜碱作用 0 小时比较分析表明，甜菜碱有诱导淋巴细胞由 G0/G1期进入 S 期的作用，且作用 18h 效果最明显，其 G0/G1期由 97.03%下降到 89.99%，S 期由 2.58%升高到 9.08%。到 24h 后，其诱导作用反而有些下降。 （Table2）Table2 Influence of Betaine on the cell-cycle of mouse splen- lymphocytes at different times（ ，n=3）xTimesCell-cycle(%)
