粪大肠菌的测定

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1、 I本电子版为发布稿。请以中国环境科学出版社出版的正式标准文本为准。 HJ 中华人民共和国环境保护行业标准 HJ/T 347 2007 水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法和滤膜法（试行） Water qualityDetermination of fecal coliformmanifold zymotechnics and filter membrane Water qualityDetermination of fecal coliformmanifold zymotechnics and filter membrane （发布稿） （发布稿） 2007-03-10 发布 2007-05-

2、01 实施 国家环境保护总局 发 布发 布I HJ/T 3472007 目 次 前言 第一篇 多管发酵法 1 适用范围 1 2 原理 1 3 培养基和试剂 1 4 步骤 2 5 结果的计算 2 第二篇 滤膜法 1 适用范围 4 2 原理 4 3 培养基和试剂 4 4 步骤 5 5 结果的计算 6 II前 言 为规划地表水环境质量标准 （GB3838-2002）的实施工作，制定本试行标准。 本标准规定了地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的多管发酵法和滤膜法。 本标准适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。 本标准为首次制订。 本标准由国家环境保护总局科技标准司提出。 本标准由国家环境保护总局

3、水和废水监测分析方法编委会组织中国环境监测总站等单位起草。 本标准国家环境保护总局 2007 年 3 月 10 日批准。 本标准自 2007 年 5 月 1 日起实施。 本标准由国家环境保护总局解释。 1 水质 粪大肠菌群的测定粪大肠菌群的测定 粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪便。在 44.5温度下能生长并发酵乳糖产酸产 气的大肠菌群称为粪大肠菌群。用提高培养温度的方法，造成不利于来自自然环境的大肠菌群生长的 条件，使培养出来的菌主要为来自粪便中的大肠菌群，从而更准确地反映出水质受粪便污染的情况。 粪大肠菌群的测定可以用多管发酵法和滤膜法。 第一篇 多管发酵法第一篇 多管发酵法 1

4、 适用范围 本标准适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。 2 原理 多管发酵法是以最可能数（most probable number）简称 MPN 来表示试验结果的。实际上它是根 据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。如果从理论上考虑，并且进行大 量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。不过只要每一稀释度试管重复数目增加， 这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。因 此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。 3 培养基和试剂 本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析

5、纯化学试剂；实验用水为新制备的去离 子水。 3.1 单倍乳糖蛋白胨培养液： 成分： 蛋白胨 10g 牛肉浸膏 3g 乳糖 5g 氯化钠 5g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL 蒸馏水 1000mL 制法：将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于 1000mL 蒸馏水中，调节 pH 为 7.27.4，再加 入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器 中，在 115灭菌 20min，贮存于暗处备用。 3.2 三倍乳糖蛋白胨培养液： 按上述配方比例三倍 （除蒸馏水外） ， 配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液， 制法同上。 2 3.3 EC 培养液

6、： 成分： 胰胨 20g 乳糖 5g 胆盐三号 1.5g 磷酸氢二钾（K2HPO4） 4g 磷酸二氢钾（KH2PO4） 1.5g 氯化钠 5g 蒸馏水 1000mL 制法：将上述成分加热溶解，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。置高压蒸汽灭菌器中，115灭 菌 20min。灭菌后 pH 应为 6.9。 3.4 培养基的存放 在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于 30的暗处，存放时应避免阳光直 接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。 4 步骤 4.1 水样接种量 将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的

7、水样量接 种。同一接种水样量要有五管。 相对未受污染的水样接种量为 10mL、1mL、0.1mL。受污染水样接种量根据污染程度接种 1mL、 0.1mL、0.01mL 或 0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。使用的水样量可参考下表 1。 表 1 接种用水量参考表 接种量(mL） 水样种类 检测方法 100 50 10 1 0.1 10-2 10-3 10-4 10-5 井水 多管发酵法 河水、塘水 多管发酵法 湖水、塘水 多管发酵法 城市原污水 多管发酵法 如接种体积为 10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液 5mL；如接种量为 1mL 或少于 1mL，则可接种于普通浓度的

8、乳糖蛋白胨培养液 10mL 中。 4.2 初发酵试验 将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在 370.5下培养 24h2h。产酸和产 气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。 4.3 复发酵试验 轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用 3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到 EC 培养液中。 在 44.50.5温度下培养 24h2h （水浴箱的水面应高于试管中培养基液面） 。 接种后所有发酵管必须在 30min 内放进水浴中。培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。 5 结果的计算 根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目， 从表

9、2 或表 3 中查得每升水样中的粪大肠菌群。 接种水样为 100mL2 份、10mL10 份、总量 300mL 时，查表 2 可得每升水样中的粪大肠菌群；接种 5 份 10mL 水样、5 份 1mL 水样、5 份 0.1mL 水样时，查表 3 求得 MPN 指数，MPN 值再乘 10，即为 1L 水样中的粪大肠菌群。 3 如果接种的水样不是 10mL、1mL 和 0.1mL，而是较低的或较高的三个浓度的水样量，也可查表 3 求得 MPN 值，再经下式计算成每 100mL 的 MPN 值。 () ()mLmL10MPNMPN接种量最大的一管指数值= 表 2 粪大肠菌群检数表 （接种水样 100m

10、L2 份、10mL10 份、总量 300m） 100mL 水量的阳性瓶数 0 1 2 10mL 水量的阳性管数1L 水样中粪大肠菌群数1L 水样中粪大肠菌群数1L 水样中粪大肠菌群数0 230 表 3 最可能数（MPN）表 （接种 5 份 10mL 水样、5 份 1mL 水样、5 份 0.1mL 水样时，不同阳性及阴性 情况下 100mL 水样中细菌数的最可能数和 95可信限值） 出现阳性份数 95%置信区间 出现阳性份数 95%置信区间 10mL 管 1mL 管 0.1mL 管 每 100mL 水 样 中 细 菌 数 的最可能数 下限 上限 10mL 管 1mL 管 0.1mL 管 每 10

11、0mL 水 样 中 细 菌 数 的最可能数 下限 上限 0 0 0 2 4 2 1 26 9 78 0 0 1 2 0.5 7 4 3 0 27 9 80 0 1 0 2 0.5 7 4 3 1 33 11 93 0 2 0 4 0.5 11 4 4 0 34 12 93 1 0 0 2 0.5 7 5 0 0 23 7 70 1 0 1 4 0.5 11 5 0 1 34 11 89 1 1 0 4 0.5 11 5 0 2 43 15 110 1 1 1 6 0.5 15 5 1 0 33 11 93 1 2 0 6 0.5 15 5 1 1 46 16 120 2 0 0 5 0.5 1

12、3 5 1 2 63 21 150 2 0 1 7 1 17 5 2 0 49 17 130 2 1 0 7 1 17 5 2 1 70 23 170 2 1 1 9 2 21 5 2 2 94 28 220 2 2 0 9 2 21 5 3 0 79 25 190 4 2 3 0 12 3 28 5 3 1 110 31 250 3 0 0 8 1 19 5 3 2 140 37 310 3 0 1 11 2 25 5 3 3 180 44 500 3 1 0 11 2 25 5 4 0 130 35 300 3 1 1 14 4 34 5 4 1 170 43 190 3 2 0 14 4

13、 34 5 4 2 220 57 700 3 2 1 17 5 46 5 4 3 280 90 850 3 3 0 17 5 46 5 4 4 350 120 1000 4 0 0 13 3 31 5 5 0 240 68 750 4 0 1 17 5 46 5 5 1 350 120 1000 4 1 0 17 5 46 5 5 2 540 180 1400 4 1 1 21 7 63 5 5 3 920 300 3200 4 1 2 26 9 78 5 5 4 1600 640 5800 4 2 0 22 7 67 5 5 5 2400 第二篇 滤膜法 第二篇 滤膜法 1 适用范围 本标准适用于一般地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。用于检验加氯消毒后的水样时， 在滤膜法之前，应先做实验，证实它所得的数据资料与多管发酵试验所得的数据资料具有可比性。 2 原理 滤膜是一种微孔性薄膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径 0.45m）的滤器中，经过抽滤，细 菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于 MFC 培养基上，44.5温度下进行培养，计数滤膜上生长的此 特性的菌落数，计算出每 1L 水样中含有粪大