《全血(液体样本)microrna快速提取试剂盒》由会员分享，可在线阅读，更多相关《全血(液体样本)microrna快速提取试剂盒（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、BLOODBLOODBLOODBLOODmisimisimisimisi全血全血（液体样本液体样本）micromicroRNARNA快速提取试剂盒快速提取试剂盒目录号目录号 1124112411241124使用手册使用手册实验室使用实验室使用，仅用于体外仅用于体外- 1 -BLOODBLOODBLOODBLOODmisimisimisimisi 全血（液体样本）全血（液体样本）microRNAmicroRNAmicroRNAmicroRNA 快速提取试剂盒快速提取试剂盒目录号：目录号：1124112411241124目录编号目录编号包装单位包装单位11241124112411240101010
2、15 5 5 50 0 0 0次次适用范围：适用范围：适用于快速提取各种全血/血浆/液体样本miRNA和其它各种小RNA试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成试剂盒组成保存保存5 5 5 50 0 0 0 次次LysisLysisLysisLysis bufferbufferbufferbuffer4 4 4 4 C C C C 避光避光5 5 5 50 0 0 0 mlmlmlml70%70%70%70%乙醇乙醇室温室温9ml9ml9ml9ml RNase-freeRNase-freeRNase-freeRNase-free H H H H2 2 2 2O O O O
3、 第一次使用前按说明加指定量乙醇第一次使用前按说明加指定量乙醇WashWashWashWash SolutionSolutionSolutionSolution 1 1 1 1室温室温12121212 mlmlmlml第一次使用前加入第一次使用前加入 2 2 2 28 8 8 8mlmlmlml 无水乙醇无水乙醇WashWashWashWash SolutionSolutionSolutionSolution 2/32/32/32/3室温室温10101010 mlmlmlml第一次使用前加入第一次使用前加入 4 4 4 42 2 2 2mlmlmlml 无水乙醇无水乙醇RNase-freeRN
4、ase-freeRNase-freeRNase-free H H H H2 2 2 2O O O O室温室温10101010 mlmlmlml吸附柱吸附柱 RARARARA 和收集管和收集管室温室温5 5 5 50 0 0 0 套套microRNAmicroRNAmicroRNAmicroRNA 吸附柱吸附柱 MAMAMAMA和收集管和收集管室温室温5 5 5 50 0 0 0 套套本试剂盒按照指示储存 6 个月不影响使用效果。- 2 -储存事项1.Wash Solution 1 和 Wash Solution 2/3 加入无水乙醇后，可以在常温保存一个月，如果要更长时间保存，请存放在 4C，
5、但是使用前，应该先回复到室温但是使用前，应该先回复到室温。2.Wash Solution 2/3 可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用就可以。3.运输在常温下进行，不影响使用效果。4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH 值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。产品介绍：产品介绍：近年来对RNA干扰和调节性小RNA的广泛研究迫切需要一种能有效提取15 -30核苷酸左右大小 RNA（包括 siRNA 和 miRNA）的试剂盒。但是传统的 RNA 提取方法如硅胶膜不能有效吸附回收，酚/胍抽提和乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子RNA，对于血液样本更是由于
6、其自身特点更难提取。本试剂盒采用独特的裂解液迅速直接裂解全血（液体样本）和灭活细胞 RNA 酶，强烈有机抽提去除蛋白和 DNA，RNA包括微小分子 RNA 吸附于离心柱内特殊硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗离心的步骤,漂洗液将细胞代谢物， 蛋白等杂质进一步去除，最后低盐的洗脱液将纯净 RNA从硅基质膜上洗脱。- 3 -产品特点：产品特点：1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。2.也不需要乙醇沉淀等容易丧失微小分子 RNA 的步骤。3.独有的裂解液配方，可直接裂解全血，不需要先裂解去除红细胞。4.多
7、次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达 1.92.0，基本无 DNA 残留,可用于 RNAi，RT-PCR，Northern-blot 和各种实验。注意事项注意事项1.第一次使用前请先在第一次使用前请先在 70%70%70%70%乙醇乙醇、WashWashWashWash SolutionSolutionSolutionSolution 1 1 1 1 瓶和瓶和 WashWashWashWash SolutionSolutionSolutionSolution 2/32/32/32/3 瓶中加瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入入指定量乙醇，加入后请
8、及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入! ! ! !2.所有的离心步骤均在室温完成所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到 13，000 rpm 的传统台式离心机，如 Eppendorf 5415C 或者类似离心机。3.需要自备乙醇，氯仿，一次性注射器，研钵。4.LysisLysisLysisLysis bufferbufferbufferbuffer 和和 WashWashWashWash SolutionSolutionSolutionSolution 1 1 1 1 含有刺激性化合物含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套操作时要戴乳胶手套，避免避免沾染皮肤沾染皮肤，眼睛和衣服眼睛和衣服。
9、若沾染皮肤若沾染皮肤、眼睛时眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗要用大量清水或者生理盐水冲洗。5.预防 RNase 污染，应注意以下几方面：1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。2)使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。3)RNA 在裂解液中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150烘烤4小时，塑料器皿可在0.5 MNaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。- 4 -4)配制溶液应使用无RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%
10、( v/v)，37放置过夜，高压灭菌。）6.RNA 纯度及浓度检测：完整性：完整性：RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度 1.2%；0.5TBE 电泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于细胞中 70%-80%的 RNA 为 rRNA，电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。 动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb，分别相当于 28S 和 18S rRNA。动物 RNA 样品中最大 rRNA 亮度应为次大rRNA 亮度的 1.5-2.0 倍，否则表示 RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。纯度：纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋
11、白质污染程度的指标。高质量的 RNA，OD260/OD280 读数（10mMTris, pH7.5）在 1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的 pH 值影响。同一个 RNA 样品，假定在 10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的 OD260/OD280 读数 1.8-2.1 之间， 在水溶液中所测读数则可能在 1.5-1.9之间，但这并不表示 RNA 不纯。浓度：浓度：取一定量的 RNA 提取物，用 RNase-free 水稀释 n 倍，用 RNase-free 水将分光光度计调零， 取稀释液进行 OD260, OD280 测定， 按照以下公式进行 RNA浓度的
12、计算：终浓度（ng/l）= (OD260)(稀释倍数 n)40。- 5 -操作步骤：操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）（实验前请先阅读注意事项） 提示：提示：一次使用前请先在 70%乙醇、Wash Solution 1 瓶和 Wash Solution 2/3 瓶中加入指定量乙醇！1.每0.25ml液体样品(血清，血浆，脑脊液等等)加入0.75ml Lysis buffer，用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中细胞。每510106个细胞至少加入0.75ml Lysisbuffer。对于含有高污染物样品如全血样品，可以用灭菌水按照1：1比例稀释一倍后开始提取。Lysis buffer和液体
13、样品的终体积比总是3：1。2.将样品剧烈震荡混匀，在15 -30C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。3.每0.75ml Lysis buffer加0.2 ml氯仿，剧烈振荡15秒并室温下放置2分钟。4.于412，000rpm 离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加Lysis buffer体积的70%。5.小心取上清（精确计算体积）转入到新的离心管，加入1.5倍体积的无水乙醇（必须是室温的） ，涡旋混匀。此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心，立刻接下步。6.将混合物(每次小于 700l,多可以分两次
14、加入)加入一个吸附柱 RA 中， （吸附柱放入收集管中）12,000 rpm 离心 30-60 秒，弃掉废液。7.加 700l Wash Solution 1（请先检查是否已加入无水乙醇请先检查是否已加入无水乙醇! ! ! !） ，12，000rpm 离心 30秒，弃掉废液。8.加入 500l Wash Solution 2/3（请先检查是否已加入无水乙醇请先检查是否已加入无水乙醇! ! ! !） ，12,000 rpm 离心30 秒，弃掉废液。加入 500l Wash Solution 2/3,重复一遍。9.将吸附柱 RA 放回空收集管中，13,000 rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液
15、, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。10.取出吸附柱 RA，放入一个 RNase free 离心管中，根据预期 RNA 产量在吸附膜的- 6 -中间部位加 30-50lRNase free water（事先在 100水浴中预热效果更好） ， 室温放置 1 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟。11.如果预期RNA产量30g,加 30-50l RNase free water 重复步骤 11, 合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要 RNA浓度高)。洗脱两遍的洗脱两遍的 RNARNARNARNA 洗脱液浓度高洗脱液浓度高, , , , 分两次洗脱合并洗脱
16、液的分两次洗脱合并洗脱液的 RNARNARNARNA 产量比前者高产量比前者高 1 1 1 15 5 5 5 30%,30%,30%,30%, 但是浓度要低但是浓度要低, , , ,用户根据需要选择。用户根据需要选择。附：附：micromicromicromicroRNARNARNARNA 富集方法富集方法（仅仅提取（仅仅提取 microRNAmicroRNAmicroRNAmicroRNA，不包含，不包含200200200200 ntntntnt 其它总其它总 RNARNARNARNA 成份成份。 ）1.按照前面标准操作步骤 15 操作，直到得到上清。2.较精确估计上清体积， 加入等体积 70乙醇 （请先检查是否已加入无水乙醇请先检查是否已加入无水乙醇! ! ! !）（必须是室温的） ，涡旋或者吹打充分混匀，不要离心。3.将混合物加入一个吸附柱 RA 中， （吸附柱放入收集管中）12,000 rpm 离
