实验室帮助 生物医学类

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1、实验室帮助实验室帮助 生物医学类生物医学类实验室达人-丁香园哦亲 1、质粒 DNA 提取 提取质粒的时候，最后一步的酒精挥发很关键，基本上是其后续的酶切反应的决定性因素。所以这一步尽量挥发长一点时间，最好是空调吹热风，或是 37 度温箱放长一点的时间，我试过室温过夜，酶切很好。 将 amp 浓度提高到 200ug/ml，下班前接种，次.想不想做一个聪明的实验室偷懒达人？ 2013 年 03 月 20 日 15:21:15 1、质粒 DNA 提取 提取质粒的时候，最后一步的酒精挥发很关键，基本上是其后续的酶切反应的决定性因素。所以这一步尽量挥发长一点时间，最好是空调吹热风，或是 37 度温箱放长

2、一点的时间，我试过室温过夜，酶切很好。将 amp 浓度提高到 200ug/ml，下班前接种，次日一早收获菌体，此时 OD 虽然不高，质粒丰度却不一般。菌体量少些，操作体积（管数）也小（少） 。手提质粒，如果用氛氯仿和氯仿两步抽提，再注意一下手法，严格按照参考书上面的操作的话，提出的质粒不比任何质粒提取试剂盒差，我感觉好像还好一点，我就用过一次试剂盒，比较了之后不如我手提的好，以后再也没用过了。2、 Western Blot 做 western blot 的时候，大家往往会摸索一抗、二抗的浓度，封闭时间，曝光时间等等，而每次变换其中的一个条件就需要从新跑胶、转膜，甚至重新提蛋白，这样会浪费 大量

3、的时间。其实完全没有必要这样。一次转膜后，将 PVDF 膜晾干，裁减成小块，保存起来，用的时候取出一块，没有任何影响。这对于摸索条件的战友来说， 节约了大量的时间。做 western blot 转膜时，胶放在转膜缓冲液中一段时间，待胶在含有甲醇的缓冲夜中缩小的差不多后装 好转膜装置，我的经验是把膜印在胶上直接在膜上画出预染 maker 条带，方便的很。因为很多时候跑电泳时胶上的预染 maker 很清楚，等转膜后就不是分辨 的很清楚了。不过要注意画好预染 maker 后就不要使胶和膜发生对位移动了，以防 maker 失去参照价值。器具的清洁非常重要，开始做前，为了安全，尤其是装胶的厚薄玻璃板，可

4、以先用中性洗涤剂和自来水反复冲洗，确保无洗涤残液后用蒸馏水冲洗 23 遍，然后用去离子水冲洗一遍。最后用 95酒精再擦一遍后晾干备用。配胶最好现用现配，先配下层胶（分离胶） ，后配上层胶（浓缩胶或积层胶） ，而且在临灌胶前加 APS 并迅速混匀，即用移液枪抽吸与注入 12 次即可。3、 缓冲液和培养基配置 （1）将缓冲液配方中的成分分别以 10-100 倍配成母液储存，需要的时候只需将相应的母液混合，补加水稀释即可；（2） 配培养基时通常会忘记各成分的量，如配 LB 时的三个成分不记得到底哪个是 5 g，哪个要 10 个，因此可以在常用的试剂瓶的标签上注明所需的量，如配 LB 时，在 NaCl

5、 瓶外注明 10 g/L， yeast 5 g/L， tryton 10 g/L 等，很方便，不需要每次配之前临时翻书。4、 PCR 在 做克隆鉴定的时候经常需要在酶切鉴定前进行 PCR 鉴定，每次配置 PCR 反应液很繁琐，可以将其配置类似 kit 的形式，按你需要的反应体系列表，然后放大 100 倍配置 100主反应液（100 次反应） ，其中含 buffer，Mg2，dNTPs，但不含引物和 Taq 酶，然后可以10分装或一管储存在 20 度，在需要的时候拿出融开，然后按所需的 PCR 反应个数吸取相应的倍数，再补加相应反应倍数的 Taq和引物，混匀后分装，这样做的好处如下：（1）可极大

6、的节省宝贵的时间，可早点收工，看球；（2）避免每次反应加样不均的可能；（3）大大减少 PCR 假阳性的产生。5、 酶切 如果是要做酶切，提质粒的最后一步最好是用水溶解 DNA，因为 TE里面的离子会影响酶切的效率。双酶切制备克隆插入片段的载体，最好选择带有外源片段的质粒，是否酶切完全，从电泳条带的分子量上可以比较明确地判断。空质粒单切完全和双切完全在分子量上差异不大。在 做酶切时，也可以象 PCR 一样配置主反应液，每次反应前先列好反应的体系，算好需要的反应数，然后按所需反应的体系按所需反应数放大，加入 buffer、 酶、水，质粒栏空缺，然后混合后按除质粒 DNA 的体积分装，然后再在每管中

7、加入相应体积的质粒 DNA 酶切，这样做的好处如下，特别是当同时有 10 几个阳性 克隆需要鉴定时尤为明显：（1）各反应成分均一；（2）可大大减少限制型内切酶的使用；（3）节省时间。6、 大肠杆菌转化实验 有 时候第一天涂的转化平板、次日早晨转化子可能长成的菌落比较大（12 毫米以上，BL21 就长得快） ，下一步转化子做质粒鉴定。这个情况下可以直接挑取一 块菌苔（勿带出培养基） ，50 微升酚/氯仿悬浮菌体，放置两分钟，加 40 微升 TE 抽提，上层 TE 吸出后再氯仿抽提一次，吸取上层 TE 即是质粒提取液。提取 的质粒可以直接用于电泳和酶切。这样操作，可以省去转接液体试管的培养步骤，至

8、少节省 68 小时的时间。但是，要在各步骤都控制得很好的情况下才能保证提 取和酶切的效果，不同的实验室或者操作者未必能够很方便地重复。转化时一定要做一个宿主菌的对照，即重组质粒涂板后再用宿主菌涂响应抗性的平板，以确定第二天长出来的克隆是否正确，我当时做了三次转化之后才发现不成功竟然是由于 BL21 可以在 Amp（+）的平板上面生长。7、 蛋白质的表达、分离、纯化 当 蛋白大量的表达时，包含体的形成几乎是不可避免的，而且很难通过改变一些诱导条件来改变，最有效的办法就是换表达系统，所以如果时间还充分的话，可以尝试 一下，如果时间较短了，还是安心的座包含体蛋白的处理算了，而且变性之后的蛋白通过一些

9、方法复性率也可以达到 60以上。8、 PCR 扩增产物的克隆 引物设计主要是要注意以下几个事项：（1）发夹结构；（2）反向配对；（3）GC 含量（4060%） ；（4）退火温度（4565 度） ；（5）引物长度（1827bp） ；（6）3 端最好是 C、G（提高结合度） ；（7）引物在序列中的错配位点。大致就这几个方面，重要性依次降低，由其是 3 端绝对不能形成发夹结构。那么你说你这段能不能设计引物呢？其实设计引物都只是好中选优的问题。9、 细胞冻存和复苏实验 （1）可以提前把需要的体积的培养液放到培养瓶里，拧松瓶盖，放到孵箱里半小时到 1 小时，这样温度和 ph 值都已经最适合细胞生长了。（

10、2） 为防止冻存管在升温时爆裂等，可以在放入水浴前就实现在超净台里把盖子拧松一下然后再拧上。从液氮罐里拿出来不是说一定要分秒必争地放入水浴。细胞从液氮 的零下 1 百多度升到比如负八十这个过程对细胞没有损害。有足够的时间 handle 这些。只不过一旦细胞化了，就应该争分夺秒地把它放入培养液了，主要是为 了稀释 DMSO。常温下高浓度 DMSO 对细胞的损害比较大。（3）水浴温度 40应该也没问题，但正规的 protocol 上从来都只说 37。反 正应该相差不大，但不能太高了。另外，不必等细胞全化了再从水浴里取出来。只要冰块浮起来了就差不多了。我一般最多水浴不超过 1.5 分钟。然后经过喷酒

11、精 消毒什么的差不多又半分钟过去了。每次都还有没化的。先把已经融解的部分吸到培养瓶里，再从培养瓶里吸些培养液到冻存管里，余下的冰块瞬间就化了，再一起 吸到培养瓶里。10、 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） （1）RT-PCR 有两种做法条件具备的话可用 kit 进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再 PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于 PCR 的进行，当然也可能是我买的 kit 不太好。 （promega） 。（2）RT-PCR 应具备的条件高质量的 RNA（保留后可做 5，3RACE） ；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑 RNA 的浓度或是 cDNA 的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将 RNA 的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样） ；体系的均一性等。（3）RACE我 做过 RACE（3RACE 是宝生物的 Kit；5RACE 是 Gibico） ，但现在再进行另一个同源基因的 3RACE 时却怎么也 P 不出来，这两个基因 是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE 的方法） ，而另一个基因的 3UTR 却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的 3UTR 太 长的缘故。