高级生化课件全

《高级生化课件全》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高级生化课件全（45页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、1高级生物化学高级生物化学（生化分离与分析技术或生物化学研究技术） 研究生的特点：“研究” 专一性、系统性。 各学科研究的共性：机理的研究(物质基础蛋白质)，通过机理的研究，使 研究者由 一叶障目 不见泰山 一叶知秋(蛋白质种类与含量的变化)。恩格斯曾说:“生命是蛋白体的存在方式,这种存在方式本质上就在于蛋白质化学成分的不断 自我更新.“ 这就是说:没有蛋白质的存在,也就没有生命。100多年前, 恩格斯提出“蛋白体” 是生命运动的物质承担者, 由此就产生了“生命是蛋白体的存在方式” 这一生命定义；恩格斯所指的蛋白 体其实是以蛋白质为主体的, 包括各种与代谢活动有关的生物分子的有机组合体。即生物

2、 体。并不是现在的单纯蛋白质。本课程的主要内容：沉淀技术、离心技术(常与沉淀技术结合使用)、层析 （色谱）技术、电泳技术、免疫化学技术(与亲和层析有重叠)、酶分析技术、 同位素示踪技术、蛋白质与核酸的序列分析技术。以蛋白质为主线（因为还有 基因工程原理课） 。 生物化学与分子生物学研究技术： 生物化学与分子生物学研究技术是研究生物大分子最基本、最重要的技术之一，是生 命科学发展过程中必不可少的重要组成部分。生物化学与分子生物学研究技术都是以生物 大分子为研究对象，是目前在生物大分子水平上研究的最常用技术。生物化学研究技术是 以蛋白质研究技术为主，介绍一些相关生物化学技术如：光谱技术、色谱技术、

3、蛋白质电 泳技术、蛋白质测序技术、超离心技术等。分子生物学研究技术是以核酸化学为主介绍一 些相关的研究技术：如基因构件、分子克隆、DNA 测序、核酸电泳等技术。从基因工程或 蛋白质工程的角度说分子生物学研究技术称之为基因工程上游技术，生物化学研究技术称 之为基因工程下游技术。前者具有一定的共性，后者具有一定的个性特点。但是从广义上 来说许多技术的原理都是相同的，只是在实际应用中各有侧重。 生物工程下游技术：泛指从工程菌或工程细胞的大规模培养一直到产品的分离纯化、分离纯化、 质量监测质量监测所需要的一系列操作技术。其中产品的分离纯化是最重要的部分。主要包括离心、 沉淀、膜分离、色谱分离、电泳分离

4、等。 目标产品蛋白质的分析检测：1. 蛋白质的含量与纯度；2. 氨基酸分析（组成种类、排 列顺序） ；3. 蛋白质的分子量测定； 4. 等电点；5. 肽谱分析（结合裂解方法） ；6. 蛋白质 的突变点分析(酶)； 7. 二硫键分析；8. 序列测定；9. 蛋白质翻译后修饰的分析。 随着蛋白质组计划的展开，下游技术显得越来越重要，以致多数用人单位要求熟悉 “色谱技术等下游技术”本课程采用讨论式 欢迎大家提出问题、积极参与讨论！参考书目参考书目 1赵永芳编著，生物化学技术原理及其应用，武汉大学出版社，赵永芳编著，生物化学技术原理及其应用，武汉大学出版社，1995 年年 7 月月 第二版第二版 2 （

5、美）（美）C.W.迪芬巴赫等著，黄培堂等译，迪芬巴赫等著，黄培堂等译，PCR 技术实验指南，科学出版社，技术实验指南，科学出版社， 1998 年年 8 月第一版，月第一版，1999 年年 4 月第二次印刷月第二次印刷 3 （美）（美）F.奥斯伯等著，颜子颖等译，精编分子生物学实验指南，科学出版社，奥斯伯等著，颜子颖等译，精编分子生物学实验指南，科学出版社， 1998 年年 6 月第一版月第一版 4杨安钢、毛积芳、药立波主编，生物化学与分子生物学实验技术，高等教育杨安钢、毛积芳、药立波主编，生物化学与分子生物学实验技术，高等教育 出版社，出版社，2001 年年 2 月第月第 1 版版5. . 陈

6、毓荃主编，生物化学实验方法和技术，科学出版社，陈毓荃主编，生物化学实验方法和技术，科学出版社，2002 年年 8 月第一版月第一版2学知识与应用：不谋全局者，不足谋一域；不谋万世者，不足谋一时。学知识与应用：不谋全局者，不足谋一域；不谋万世者，不足谋一时。 学习的动力：有人说求名计利：计利当计天下利，求名应求万世名学习的动力：有人说求名计利：计利当计天下利，求名应求万世名 学习的态度：水惟善下方成海，山不矜高自极天学习的态度：水惟善下方成海，山不矜高自极天 待人：反观自己难全是，细论人家未尽非待人：反观自己难全是，细论人家未尽非 对钱：事能知足心常惬，人到无求品自高对钱：事能知足心常惬，人到无

7、求品自高 烦恼：欲除烦恼须无我，历尽艰难好做人烦恼：欲除烦恼须无我，历尽艰难好做人 交友：友如作画须求淡，文似看山不喜平交友：友如作画须求淡，文似看山不喜平 学习内容：世事洞明皆学问，人情练达即文章学习内容：世事洞明皆学问，人情练达即文章 做事：欲除天下不平事，方显人间大丈夫做事：欲除天下不平事，方显人间大丈夫前序：前序：要从生物体内获得某一组分进行分析与研究，首先要确定取样对象及其要从生物体内获得某一组分进行分析与研究，首先要确定取样对象及其 部位！部位！ 一、取样的原则一、取样的原则 1、取样的代表性：代表研究对象的本质，从自然群体或待研究的群体中取取样的代表性：代表研究对象的本质，从自然

8、群体或待研究的群体中取 样；样本量小于样；样本量小于 30 份为小样本，大于份为小样本，大于 30 则为大样本；研究病例时，可则为大样本；研究病例时，可 能只有一个样本，难于总结出规律能只有一个样本，难于总结出规律(只能对症医治) 2、部位：表现研究特征与本质的部位，越精细越好，如：表现特征的部位，部位：表现研究特征与本质的部位，越精细越好，如：表现特征的部位， 缺锌的叶主脉两侧、缺钙的根尖、茎尖等停长坏死。研究癌细胞就要从缺锌的叶主脉两侧、缺钙的根尖、茎尖等停长坏死。研究癌细胞就要从 癌组织中取样。细胞分化常常从某一个细胞或几个细胞开始，所以取样癌组织中取样。细胞分化常常从某一个细胞或几个细

9、胞开始，所以取样 要精细，才能有针对性。要精细，才能有针对性。 二、提取与分离或制备样品分子二、提取与分离或制备样品分子 1. 生化分离分为分离分析与分离制备，分离分析即分离各组分，而进行定生化分离分为分离分析与分离制备，分离分析即分离各组分，而进行定 量与定性鉴定，不一定把某组分从混合物中分离提取出来，如，氨基酸的定性量与定性鉴定，不一定把某组分从混合物中分离提取出来，如，氨基酸的定性 与定量分析。与定量分析。 分离制备则是为获得某一单纯组分。并有活性或生理功能，这与其结构有分离制备则是为获得某一单纯组分。并有活性或生理功能，这与其结构有 关，所以，生化分离与化学分离不同，要保证其结构和性质

10、不改变。有如下特关，所以，生化分离与化学分离不同，要保证其结构和性质不改变。有如下特 点：点： 成分复杂且时刻在发生代谢变化。成分复杂且时刻在发生代谢变化。 有的含量很少，用材料多。如，激素、酶等。有的含量很少，用材料多。如，激素、酶等。 离开活体易变性，所以条件要温和，且低温离开活体易变性，所以条件要温和，且低温 使代谢减慢不变质。使代谢减慢不变质。 都在溶液中进行，影响因素多，要重复性好，就必须严格规定材料、方都在溶液中进行，影响因素多，要重复性好，就必须严格规定材料、方 法、条件与试剂等。法、条件与试剂等。 均一性鉴定需多种方法：层析、电泳、染料显色、理化特性分析等。均一性鉴定需多种方法

11、：层析、电泳、染料显色、理化特性分析等。 故生化分离与制备大都根据混合物中不同组分分配率的差别（顺其自然，故生化分离与制备大都根据混合物中不同组分分配率的差别（顺其自然， 先试验再总结规律，用于实践）先试验再总结规律，用于实践） ，将它们分配于可用机械方法分离的两个或几个，将它们分配于可用机械方法分离的两个或几个 物相中（如有机溶剂抽提油脂、盐析、结晶等沉淀分离蛋白）物相中（如有机溶剂抽提油脂、盐析、结晶等沉淀分离蛋白） ，或将混合物置于，或将混合物置于 某一物相中（多是液相）某一物相中（多是液相） ，外加一定的作用力，使各组分分配于不同区域而分离，外加一定的作用力，使各组分分配于不同区域而分

12、离 （如电泳、超离心、超滤等）（如电泳、超离心、超滤等） 。先介绍溶剂提取、沉淀、膜分离、浓缩与干燥。先介绍溶剂提取、沉淀、膜分离、浓缩与干燥。 现代生化分离制备常用沉淀、离心、层析、电泳四大技术。现代生化分离制备常用沉淀、离心、层析、电泳四大技术。 第一节第一节 溶剂提取法溶剂提取法 利用溶剂的溶解作用，从细胞中提取所需物质，这里影响物质溶解度即影利用溶剂的溶解作用，从细胞中提取所需物质，这里影响物质溶解度即影3响提取的因素主要有：响提取的因素主要有： 1溶质的性质：如，溶质的性质：如，DNA、RNA 易溶于盐溶液中易溶于盐溶液中【DNADNA 提取缓冲液（提取缓冲液（500mM500mM

13、NaClNaCl、100100 mMTrisHClmMTrisHCl、50mM50mM EDTAEDTA） 】，微溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质中清，微溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质中清 蛋白：溶于水与稀盐溶液；球蛋白不溶于水，溶于稀盐；谷蛋白可溶于稀酸稀蛋白：溶于水与稀盐溶液；球蛋白不溶于水，溶于稀盐；谷蛋白可溶于稀酸稀 碱，但不溶于水碱，但不溶于水 2溶剂的性质，溶剂的性质，相似相溶原理（极性）相似相溶原理（极性） 。 酸、碱互溶机制：碱性物质酸、碱互溶机制：碱性物质 易溶于酸性溶剂中，反之亦然；易溶于酸性溶剂中，反之亦然；极性溶剂中，溶解极性物质，溶剂的介电常极性溶剂中，溶解极性物质，溶

14、剂的介电常 数减小一些溶质的溶解度就减小。可通过丙酮等沉淀一些蛋白。数减小一些溶质的溶解度就减小。可通过丙酮等沉淀一些蛋白。 3离子强度：离子强度：I=1/2CZ2 （Z：离子价数，：离子价数，C：离子的摩尔浓度）高盐中：离子的摩尔浓度）高盐中 DNA 溶解度大，低离子强度下溶解度大，低离子强度下 RNA 溶解度大，溶解度大，0.14mol/LNaCl 中可溶出中可溶出 RNA 而沉淀而沉淀 DNA(一般以一般以 2mol/L 氯化钠溶解氯化钠溶解)。蛋白质在稀盐中，比水中溶解度大，。蛋白质在稀盐中，比水中溶解度大， 称为盐溶效应，此乃少量离子的活动，减少了蛋白质分子极性基团之间的静电称为盐溶

15、效应，此乃少量离子的活动，减少了蛋白质分子极性基团之间的静电 引力，加强了蛋白质与溶剂间的相互作用之故。低盐还可稳定一些物质的生理引力，加强了蛋白质与溶剂间的相互作用之故。低盐还可稳定一些物质的生理 活性，所以生化物质多用之提取。活性，所以生化物质多用之提取。 4pH：溶剂的：溶剂的 pH 值影响溶质的解离状态，离子态易溶于水，分子态则易值影响溶质的解离状态，离子态易溶于水，分子态则易 溶于有机溶剂，酸性物质在低溶于有机溶剂，酸性物质在低 pH 下或碱性物质在高下或碱性物质在高 pH 下均可转溶于有机溶下均可转溶于有机溶 剂，两性物质在等电点之外，均成离子态，所以剂，两性物质在等电点之外，均成

16、离子态，所以 AA 一般不用有机溶剂提取。一般不用有机溶剂提取。 Pr、酶等还要考虑、酶等还要考虑 pH 对其活性的影响，一般控制在对其活性的影响，一般控制在 pH68 左右，避免过酸、左右，避免过酸、 过碱。过碱。 5温度：高温时溶解度增大，但易变性，绝大多数生物大分子，提取温度温度：高温时溶解度增大，但易变性，绝大多数生物大分子，提取温度 选在选在 010，避免变性。，避免变性。 6去够剂（双亲物质）：具有乳化、分散和增溶作用；有阴、阳离子和中去够剂（双亲物质）：具有乳化、分散和增溶作用；有阴、阳离子和中 性去垢剂等多种类型，中性去垢剂有性去垢剂等多种类型，中性去垢剂有 Tween20、40、60、80（聚氧乙烯（聚氧乙烯（20） 山梨醇酐单油酸酯）山梨醇酐单油酸酯） ，Triton X-100（非离子型系列去污剂的商品名（非离子型系列去污剂的商品名 为聚乙二醇为聚乙二醇 辛基苯基醚）等，对蛋白质和酶的变性影响较小，