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1、1碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒一、基本概念 1质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的 DNA 分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状 DNA 分子，这就是质粒(plasmid)。质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的 DNA 分子。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，
2、已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状 DNA 分子(简称 cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的 0.5%3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是 40106 以上，较小一类的相对分子质量是 10106 以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有 12 个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有 20 个左右质粒。一般分子量较大的质粒
3、属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有 pBR322、pSC101。pBR322 含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有 5 种内切酶的单一切点。如果将 DNA 片段插入 EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将 DNA 片段插入到HindIII、BamHI 或 SalI 切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有 DN
4、A 插入片段的 pBR322 将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有 DNA 插2入片段的 pBR322 会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有 pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。pSC101 与 pBR322 相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和 PstI 切点。质粒运载体的最大插入片段约为 10kb(kb 表示为千碱基对)。pGEX-4T1 是 pGEX 载体系列的一种，载体图如图 2 所示，这类载体是溶蛋白表达、纯化和检测为一体的整合系统。具有以下优点：有一个可以用化学物质（IPTG）诱导的高效表达的 tac 启动子；一个 lacIq 基因以便通用于所有E.c
5、oli 宿主中；一个 AmpiR 基因以便于阳性克隆的筛选。 pGEX-4T1 载体示意图2感受态细胞：重组 DNA 分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组 DNA 分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源 DNA 片段并实现其3转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cA
6、MP 可以使感受态水平提高一万倍，而 Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积 15%的无菌甘油或-70保存（有效期 6 个月） 。3.转化:是将异源 DNA 分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的 DNA 分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。转化的方法：化学的方法(热击法)；使用
7、化学试剂（如 CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体 DNA 分子导入受体细胞；电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体 DNA 分子导入受体细胞。二、碱裂解法质粒提取的原理碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。下面是该法的提取原理: 碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液 I，50 mM 葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液 II，0.2 N NaOH / 1% SDS；(N 相当于 g/L，是当量浓度)溶液 III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。 溶液 I 的作用任何
8、生物化学反应，首先要控制好溶液的 pH，因此用适当浓度的和适当 pH值的 Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。那么 50 mM 葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积4到管子的底部。EDTA 是 Ca2+和 Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制 DNase 的活性，和抑制微生物生长。在溶液 I中加入 EDTA 是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。 溶液 II 的作用这是用新鲜的 0.4 N 的 NaOH 和 2的 SDS 等体积混合后使用的。要新从浓NaOH 稀
9、释制备 0.4N 的 NaOH，是为了保证 NaOH 没有吸收空气中的 CO2 而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是 SDS，所以才叫碱法抽提。事实上 NaOH 是最佳 的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的 0.4 N NaOH，即便是有 SDS 也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS 当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS 也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对 NaOH 的作用误以为是为了让基因组 DNA
10、变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关 DNA 变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是 NaOH 溶解的细胞，那为什么要加 SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组 DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组 DNA 也会断裂。基因组DNA 的断裂会带来麻烦。 溶液 III 的作用溶液 III 加入后就会有大量的沉淀，与 SDS 的加入有关系。十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）SDS 遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS）
11、，而 PDS 是水不溶的，因此发生了沉淀。溶液 III 加入后的沉淀实际上是钾离子置换了 SDS 中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道 SDS 专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组 DNA 也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组 DNA 太长了，长长的 DNA 自然容易被PDS 给共沉淀了，尽管 SDS 并不与 DNA 分子结合。52 M 的醋酸是为了中和 NaOH，因为长时间的碱性条件会打断 DNA，所以要中和之。基因组 DNA 一旦发生断
12、裂，只要是 50100 kb 大小的片断，就没有办法再被 PDS 共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组 DNA 混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总 DNA 条带。很多人误认为是溶液 III 加入后基因组 DNA 无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA 分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH 本来是为了溶解细胞而用的，DNA 分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液 III 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了 PDS 沉淀更充分一点。酚/氯仿纯化不要以为 PDS 沉淀的形成就能将所有
13、的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒 DNA，不然时间一长就会因为混入的 DNase 而发生降解。这里用 25/24/1 的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如 4M的异硫氰酸胍） ，离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶
14、解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应） ，因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。 回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入 2 倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒 DNA 沉淀出来。这时候如果放到20，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的 DNA 酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子，因此 DNA 分子之
15、间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用 70的乙醇多洗几次，每次6在室温放置一个小时以上，并用 tip 将沉淀打碎，就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含 RNase（50 ug/ml）的 TE 缓冲液进行溶解，不然大量未降解的 RNA 会干扰电泳结果的。质粒检测琼脂糖电泳进行鉴定质粒 DNA 时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性 DNA，不信的话你用 EcoRI 来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒 DNA 的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋
16、、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起） 。如果你不小心在溶液 II 加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是 20-100kb 的大肠杆菌基因组 DNA 的片断。 非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有 710 条带，这是由于特殊的 DNA 序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。三、实验步骤1大肠杆菌感受态细胞的制备（可临用前准备，也可制备多管加甘油冻存-80）（1）从新鲜的DH5菌株平板上挑取一个单菌落， （接种到4ml LB液体培养基中）37，180rpm培养过夜。（2）次日按照1：100的比例转接培养物于20mlLB液体培养基当中，37，180rpm培养至OD值达到0.4-0.6。（3）取培养物1ml到1.5ml 离心管中，冰浴10min，5000rpm离心5min收集菌体。（4）弃上清，加入预冷的0.1M CaCl2 1ml 后旋起菌体（在涡旋器上振荡） ，冰浴30min。（5）5，000rpm离心10min后弃上清，加入预冷的0.1M CaCl2 100ul。（6）温和混匀后4放置
