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1、细胞凋亡的几种检测方法细胞凋亡的几种检测方法 203116203116一、形态学观察方法1、HE 染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。2、丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，
2、常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。二、DNA 凝胶电泳（一） 、检测原理细胞发生凋亡或坏死，其细胞 DNA 均发生断裂，细胞内小分子量DNA 片断增加，高分子 DNA 减少，胞质内出现 DNA 片断。但凋亡细胞 DNA 断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现 180200bpDNA片断，而坏死细胞的 DNA 断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。（二）结果判断正常活细胞 DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞 DNA 电泳类似血抹片时的连续性条带。三、酶联免疫吸附法（
3、ELISA)核小体测定凋亡细胞的 DNA 断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的 DNA 片断组成，可由 ELISA 法检测。（一）检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合4、加辣过氧化物酶标记的抗 DNA 抗体使之与核小体上的 DNA 结合4、加酶的底物，测光吸收制。（二）用途该法敏感性高，可检测 5*100/ml 个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。四、流式细胞仪定量分析（一）检测原理细胞发生凋亡时，其
4、细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。（二）应用价值流式细胞仪检测具有以下特点：1)、检测的细胞数量螅虼似浞从橙禾逑赴牡蛲鲎刺冉献既?BR2)、可以做许多相关性分析3)、结合被检测细胞的 DNA 含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期检测形态学及细胞膜完整性的 Hoechs-PI 双染色法细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正
5、常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。利用 Hoechs-PI 染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取 Hoecha 染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI)而呈强的红色荧光。DNA 片断原位标记法凋亡细胞 DNA 片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT)相反应与凋亡细胞裂解后 3的羟基（OH）端结合，经显色反应后检测 DNA 裂解点的技术。DNA 片段原位标记法有二种：1、原位缺口转移（in situ nick-t
6、ranslation,ISNT)技术，它是利用 DNA 多聚酶 I 将标记的核苷酸连接到断裂 DNA 的 3OH 端2、原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique,ISEL)，即 TUNEL 法，它是利用 TdT 将标记的 DUPT 接到3-OH 端。研究证明，TUNEL 法的敏感性远高于 ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL 更为合适。检测细胞膜成分变化的 Annexin V 联合 PI 法1、原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白 V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于 PS
7、 具有高度的结合力。因此，Annexin V 可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对 PS 有高度亲和力的 Annexin V，将 Annexin V 标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素 FITC） ，同时结合使用 PI 拒染法（因坏死细胞 PS 亦暴露于细胞膜外测，且对 PI 高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。2、结果判断：正常活细胞 Annexin V 、PI 均低染；凋亡细胞Annexin V 高染、PI 低染；坏死细胞 Annexin V/PI 均高染。3、应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的 PS 外露早于 DNA 断裂发生，因此 Annexin V 联
8、合 PI 染色法检测早期细胞凋亡较 TUNEL 法更为灵敏。又 Annexin V 联合 PI 染色不需固定细胞，可避免 PI 染色因固定造成的细胞碎片过多及 TUNEL 法因固定出现的 DNA 片段丢失。因此，Annexin V 联合 PI 法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。 几点参考1.大部分凋亡细胞可能并不见得有非常典型的凋亡表型，如电镜的染色体边集、凋亡小体等，DNA 电泳也不见得都有 DNA ladder，但对某些指标来说还算稳定，如 PI 染色及 TUNEL 法，所以如果某个方法效果不好，可以换用其他方法检测2.坏死与凋亡的区分传统上认为是无序与有序的过程，楼上所说的线粒体肿大也是以前的一个传统认识，但现在有很多人认为坏死的发生也是有序发生的，因此也有了程序化坏死一说，在很大程度上，由于凋亡是时间依赖性的过程，细胞发生凋亡也并非同步化的，凋亡的晚期与坏死进行区分是困难的，而且我认为如果不是对于凋亡或是坏死本身通路进行研究的话，强行区分是没有意义的。
