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1、l I MI 1 l l l l l l l l 1 l 1 l l l l l l l l l l l J l l l l l l 0 Y 2 5 7 0 14 1I n d u c t i o no fa p o p t o s i sb yo s t h o l ei nl e u k e m i ac e l la n dt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mr e s e a r c hB yW a n gY a nU n d e rt h eS u p e r v i s i o no fP r o f e s s o rB iK e - h
2、 o n gAT h e s i sS u b m i t t e dt ot h eU n i v e r s i t yo fJ i n a nI nP a r t i a lF u l f i l l m e n to f t h eR e q u i r e m e n t sF o rt h eD e g r e eo fM a s t e ro fM e d i c i n eU n i v e r s i t yo fJ i n a nJ i n a n ，S h a n d o n g ，P R C h i n aM a y ，2 0 1 4研究生导师及课题小组成员简介研究生导
3、师介绍：毕可红，女，1 9 6 3 年生人，硕士学位，山东省千佛山医院血液科主任、主任医师，山东大学教授、硕士研究生导师，兼任山东省医师协会血液病分会副主任委员，山东省血液免疫学分会副主任委员，山东省医学会血液病学专业委员会副主任委员，山东省输血协会理事。1 9 8 6 年毕业于青岛大学医学院医疗系。一直在省千佛山医院血液内科从事血液病学临床教学、科研工作，曾访问学习于瑞典卡罗林斯卡医学院。从事血液病学专业医教研工作2 0 余年，为人善良，朴实豁达，公道正派，具有执着的事业追求，较强的探索创新精神，广博扎实的血液病学理论基础和专业知识，能及时掌握本学科研究方向和国内外发展动态，并能根据医院和专
4、业发展需要确定新的研究方向。有丰富的临床工作经验，尤其擅长诊治各种类型贫血、各种类型白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、过敏性紫癜及血小板减少症等各种出血性。目前正为首主持山东省科技攻关项目3 项，省自然科学基金课题和卫生厅课题各1 项，为主承担省级课题3 项，获部级科技进步二等奖一项，省科技进步二等奖2 项，省自然科学三等奖2 项，省医学科技进步一等奖一项，省医学科技进步三等奖二项。发表专业论文3 0 余篇，参编著作4 部。目前共培养在职攻读硕士学位研究生3 名，统招硕士研究生5名。现致力于血液系统恶性疾病的诊治及发病机制研究。课题指导小组成员：姜国胜，男，研究员，长期从事肿瘤
5、免疫方面的工作与研究。郭燕，女，主治医师，长期从事血液病的诊断与治疗研究。任霞，女，助理研究员，长期从事肿瘤免疫方面的研究工作。原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：王券日期：加l 平r 如关于学位论文使用授权的声明本人完全了解济南大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和
6、借鉴；本人授权济南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。么开口保密(年，解密后应遵守此规定)论文作者签名：王朱导师签名：绛扒日期：丸f 中f ) 。济南大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：，乌土仆日期：力l 、P 0 k关于学位论文使用授权的声明
7、本人完全了解济南大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借鉴；本人授权济南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。公开保密( 年，解密后应遵守此规定)论文作者签名：壬未导师签名：肱扒嗍丸叶A 丸济南大学硕士学位论文目录摘要I I IA B S T R A C T V主要符号表二、实验材料与主要方法42 1 主要实验仪器与试剂42 2 蛇床子素诱导H L 6 0 细胞及人骨髓白血病细胞的凋亡72 3R T - P C R 检测细胞凋亡相关基因m R N
8、 A 相对表达量的变化92 4W e s t e mb l o t 检测细胞凋亡蛋白表达的变化1 02 5 统计学处理方法一1 1三、结果1 23 1蛇床子素诱导白血病细胞的凋亡1 23 2 蛇床子素诱导H L 6 0 细胞凋亡的机制1 5四、讨论1 9五、结论2 6参考文献2 7蛇床子素诱导白血病细胞凋亡与分子机制研究综j 盔3 1攻读硕士学位期间的研究成果3 9致谢4 0济南大学硕士学位论文蛇床子素诱导白血病细胞凋亡及机制研究研究生王岩导师毕可红主任医师专业内科学摘要目的：白血病是血液系统中常见的恶性肿瘤，发病原因复杂，分型多，治疗困难，预后差，常规化疗效果差，而且毒副作用大，患者常常因并
9、发感染或出血导致早期死亡。因此白血病的治疗更需要一种缓解率高，毒副作用小的有效药物。蛇床子素是我国的传统中药蛇床子的提取物。具有解痉、抗炎等多种药理作用。并且近些年发现蛇床子素还具有通过诱导肿瘤细胞凋亡的抗肿瘤作用，已在多种实体瘤细胞株中得到证实，并对其凋亡机制做了部分研究，但针对血液系统肿瘤的研究较少，只有少数实验证明蛇床子素对H L 一6 0 细胞有抑制增殖作用，但其凋亡机制方面未见有文献报告，故本实验以此为基础，研究蛇床子素对白血病细胞的作用及作用机制，旨在发现一种效果好并且毒副作用小的新型白血病治疗药物，并为今后相关方面的研究提供理论依据。方法：取对数期生长的H L 6 0 细胞建立蛇
10、床子素诱导H L 6 0 细胞凋亡的模型，利用淋巴细胞分离液分离提取白血病病人人新鲜骨髓中的白血病细胞，C C K 8 方法检测细胞增殖情况，H o e c h s t3 3 3 4 2 染色观察细胞凋亡前后细胞核形态学变化，流式细胞术检测细胞凋亡率，逆转录聚合酶链式反应( I m P C R ) 技术检测细胞凋亡前后凋亡相关基因m R N A 表达水平变化，蛋白质印记( W e s t e r nb o l t ) 方法检测凋亡相关蛋白表达变化，采用S P S S1 9 0 进行统计学分析，测定数值用均数土标准差( i 蚜) 表示，f 检验用于均数比较，不同组间比较采用单向方差分析，以p 0
11、 0 5 ) 。提示B c l 2 基因随细胞凋亡增多表达下调，B a x 、C a s p a s e3 基因表达随细胞凋亡增多而上调。c o n t r o l1 0 0 t E N ，i2 0 0 心互4 0 0 L u I2 9 6 b p1 7 2 b p5 4 0 b p孽8 乏o 、5 酵。1 60 0穗，1 国。lr 4 毫o0 寒零i0 0 6蓬；o j 冀0 ；B a x B c l 一2“0 ；“醛：，药物浓度( 心主)c c v - a t r o ll m M2 0 0 心ippppbbbb多0毒gS4041 一i 。 j彳J隰 一 一一贴弱陋耋!孙济南大学硕士学位论
12、文3 2 2 细胞凋亡蛋白B c l 一2 、B a x 、C a s p a s e3 、C a s p a s e8 、C a s p a s e9 、F a s 、F a s L 表达改变为进一步论证其凋亡机制，根据蛇床子素诱导实体瘤细胞凋亡为依据，又进行了W e s t e mb l o t 实验。收集药物浓度2 0 01 a M 分别处理细胞4 h 、8 h 、1 2 h 后的H L 6 0 细胞，以未加药组为对照。检测细胞凋亡过程中内源性、外源性凋亡通路中关键蛋白因子表达情况。结果显示B c l 2 蛋白条带随培养时间延长逐渐变淡( F = 1 3 4 8 3 ，p 000一曲o一
13、口芑-氛济南大学硕士学位论文四、讨论蛇床子素是天然存在的香豆素类化合物，又名甲氧基欧芹酚或欧芹酚甲醚，是从中药蛇床子中分离的萃取物。为脂溶性无色结晶状物质，不溶于水，可溶于有机溶剂。国内外大量实验已明确证明，蛇床子素具有显著的通过诱导细胞凋亡的抗肿瘤作用。凋亡是细胞主动死亡的过程，由各种损害因素刺激细胞而激活，全程涉及能量的消耗及细胞基因表达的自我调控。因此凋亡过程中根据不同阶段基因表达产物的不同，会产生一系列的特征性形态学变化，如D N A 的片段化断裂降解，形成阶梯状规律电泳条带，细胞皱缩、细胞膜出芽包裹胞质和细胞器形成凋亡小体，特异性凋亡产物P R A P 、C a s p a s e3
14、蛋白的表达增加等，上述变化均可将细胞凋亡与细胞坏死进行区分，因此为了明确蛇床子素抗肿瘤药理作用的发挥途径，区分其诱导细胞死亡的方式，研究者们利用不同实验手段，如A n n e x i n v P I 、D N A 断裂片段蛋白检测、细胞周期检查等，对其进行了验证。最终发现蛇床子素可以在体内及体外均可以有效抑制肿瘤细胞的增殖，并且这种抑制作用是通过诱导肿瘤细胞的凋亡实现的。目前就蛇床子素的研究主要集中于实体瘤细胞方面，如肝癌、肺癌、乳腺癌等在我国发病率相对较高的肿瘤。目前对肝癌、肺癌细胞的研究较为详细透彻。不同研究的不同实验者各自选取人S K H P 1 、S M M C 7 7 2 1 、H e p G 2及小鼠H e p l 6 肝癌细胞株为研究对象，进行了蛇床子素抗肝癌的体内和体外实验，取蛇床子素浓度2 0 5 2 0 5p , M 分别作用2 4 、4 8 、。7 2 h ，发现4 种细胞均有明显的增殖抑制作用，每种细胞间无明显差异，并且这种作用具有时间剂量依赖性，S M M C 7 7 2 1 细胞2 0 5p , M 作用7 2 h ，抑制率接近1 0 0 。蛇床子素1 2 3g M 作用4 8 h 后S M M C 7 7 2 1 及H e p l 6处于G 2 期阻滞状态的细胞分别由3 5 、3 9 2 上升至1 2 1 8 及1 2 9 9 ；
