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1、头孢噻呋对照品的研制张秀英 王小慈 陆连寿 王在时(中国兽医药品监察所，北京 100081)摘要摘要 本文按照国家对照品的研制原则，进行了头孢噻呋国家对照品的研制。通过稳定性研究，确定了选用盐酸头孢噻呋作为对照品原料，然后对所选取原料用元素分析、红外分光光度法和液相色谱法确证了头孢噻呋的结构。用液相色谱法测定纯度为 96.8%，含量赋值为 87.5%。关关键词键词 头孢噻呋 结构确证 纯度 含量Reparation of Ceftiofur Reference StandardsZHANG xiu-ying,WANG xiao-ci,LU lian-shou,WANG zai-shi(Chin
2、a Institute of Veterinary Drug Control,Beijing 100081;China)Abstract: According to guide lines for the establishment of national chenmical reference standards,we study and repare ceftiofu reference standards.We select the Ceftiofur hydrochloride as material resouce of reference standards by studying
3、 of stablity.Then confirm chemical structure by element analysis, IR and HPLC. The purity and assigned content is 96.8% by HPLC.Key words: Ceftiofur hydrochloride；confirm chemical structure；purity；content头孢噻呋是第三代动物专用头孢类抗生素，是由 Bernard Labeeuw 和 Moutpollier 等人于 1984 年合成。目前在我国注册的国外生产商有美国辉瑞公司（原美国普强公司）和韩
4、国LG 公司。2004 年起，国内多家企业也纷纷仿制生产该药并已获准上市。但由于国际和国家头孢噻呋对照品，我国的生产企业由于只能用 sigma 公司的头孢噻呋试剂作为对照品来控制产品的质量，由于试剂的测定方法和含量的赋值在精确度上都有很大的误差，引起产品的含量与实际值相差较大，由此可见对照品在有效地控制产品的质量中起着关键的作用。1 仪器与材料仪器与材料1.1 仪器 waters 2695 高效液相色谱仪，2487 紫外检测器；GR202 电子分析天平，精度 0.01mg；元素分析仪；BrukerTensor27 型傅立叶变换红外分光光度计；787 KF Titrino 卡项目：生物化学计量标
5、准资源整合与共享体系建设项目资助作者简介：张秀英（1972 年），女，副研究员，从事标准物质研究。E-mail:氏水分测定仪；DHG-9240 A 型电热恒温鼓风干燥箱；CWF11/5 型高温炉；YMC 2504.6mm 色谱柱。1.2 试药 对照品原料（盐酸头孢噻呋精制原料） ，由山东齐鲁药厂提供；头孢噻呋钠原料来自其他生产企业；头孢噻呋试剂(批号：80370-57-6，公司提供纯度：99.5%)，购自sigma-aldrich 公司；原研发企业头孢噻呋工作对照品，由辉瑞公司提供。乙腈、三氟乙酸均为色谱纯；水为超纯水；醋酸铵，冰醋酸，四丁基氢氧化铵，四氢呋喃为分析纯。2 方法方法2.1 原料
6、筛选稳定性研究 按农业部颁布的“原料药稳定性试验技术规范”【1】要求进行加速试验，用高效液相色谱法2测定有关物质含量的变化。2.1.1 色谱条件 流动相 A：水乙腈三氟醋酸（950:50:1） ；流动相 B：水乙腈三氟醋酸（200:800:1） ，梯度洗脱程序如下：时间（分钟） 流动相 A(%) 流动相 B(%)0 100 0 5 100 0 35 60 40 50 0 100 55 0 100 60 100 0 75 100 0检测波长为 254nm。2.1.2 供试液制备 取供试品，用流动相稀释制成每 1ml 中含头孢噻呋 0.3mg 的溶液，进样量 20l。按峰面积归一化法计算杂质总含量
7、。2.2 结构确证2.2.1 元素分析 委托中国科学院化学研究所进行元素分析。2.2.2 红外光谱测定 用 kBr 压片法进行红外光谱分析3。2.2.3 高效液相色谱测定4 2.2.3.1 液相色谱条件 以醋酸铵溶液（取醋酸铵 3.85g，加 10%四丁基氢氧化铵13.5ml，加水至 700ml，用冰醋酸调节 pH 值至 6.66.8）甲醇四氢呋喃（700:200:110）为流动相；检测波长为 254nm。2.2.3.2 供试液制备 取本品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释至每 1ml 中约含头孢噻呋 0.1mg 的溶液，立即精密量取 20l，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取辉瑞公司提供的原始
8、基准物质，同法测定。2.3 纯度测定 采用 3 种高效液相色谱法，均按峰面积归一化法计算杂质总含量2.3.1 方法 1 同稳定性试验方法。2.3.2 方法 2 同 2.2.3 结构确证方法，制备 5 份供试品溶液，每份溶液进针 2 次。2.3.3 方法 3 采用 sigma-aldrich 公司提供的头孢噻呋试剂的纯度测定方法(HPLC 法)。2.3.3.1 液相色谱条件 流动相为乙腈-水-磷酸(80:20:0.04)，检测波长为 250nm。2.3.3.2 供试液制备 取供试品，用流动相稀释制成每 1ml 中含头孢噻呋 0.3mg 的溶液，进样量为 20l。2.4 对照品原料的质量检验和标定
9、2.4.1 干燥失重 按中国兽药典干燥失重方法，105干燥至恒重3。2.4.2 炽灼残渣 按中国兽药典炽灼残渣方法测定3。2.4.3 含量测定和赋值 高效液相色谱法 见 2.2.33 测定结果3.1 稳定性试验结果 见表 1表 1 加速稳定性试验有关物质结果汇总表加速试验加速试验头孢霉头孢霉 素素537 分子量分子量 的物质的物质4-酮基头酮基头 孢噻呋孢噻呋-3 顺式肟顺式肟-3 反式肟反式肟总杂质总杂质0 天0.1%/1.5%0.4%7.4%光照 5 天0.1%/1.6%0.5%8.0%光照 10 天0.04%0.1%0.3%1.9%0.8%9.9%高温 60 5 天0.1%/0.02%2
10、.3%0.5%9.0%头孢 噻呋 钠 样 1高温 60 10 天0.2%0.02%0.2%2.8%0.4%9.9%0 天0.1%/1.5%0.4%8.4%光照 5 天0.3%/1.5%0.4%7.5%光照 10 天0.1%0.06%0.2%1.6%0.3%9.1%高温 60 5 天0.1%/0.02%2.3%0.5%9.0%头孢 噻呋 钠 样 2高温 60 10 天0.2%0.04%0.2%2.8%0.4%10.5%0 天/0.1%0.4%0.04%3.3%光照 5 天/0.06%0.4%0.06%3.5%光照 10 天0.2%/0.2%0.5%0.6%5.0%高温 60 5 天/0.06%0
11、.06%0.7%0.03%5.1%头孢 噻呋 钠 样 3高温 60 10 天0.2%/0.2%0.7%0.03%5.0%0 天/0.1%0.4%0.06%3.3%光照 5 天/0.09%0.4%0.1%3.5%头孢 噻呋 钠光照 10 天0.2%/0.2%0.5%0.6%5.0%高温 60 5 天0.04%0.06%0.05%0.7%0.02%5.6%样 4高温 60 10 天0.2%/0.2%0.7%0.03%5.3%0 天/0.07%/3.2%光照 5 天/0.1%1.0%4.2%光照 10 天0.1%0.2%/0.1%1.4%3.5%高温 60 5 天/0.09%0.2%3.2%对照 品
12、原 料 1高温 60 10 天/0.05%/0.1%0.2%2.6%0 天/0.05%/3.2%光照 5 天/0.03%0.1%1.0%4.6%光照 10 天0.09%0.2%/0.1%1.4%5.3%高温 60 5 天/0.09%0.2%2.5%对照 品原 料 2高温 60 10 天/0.05% /0.1%0.2%2.5%盐酸头孢噻呋经加速试验，杂质含量最高为 5.3%，而头孢噻呋钠加速试验后杂质含量最高达到 10.5%。可见盐酸头孢噻呋比头孢噻呋钠稳定，确定为对照品原料。3.2 结构确证结果 3.2.1 元素分析测得各元素含量为：Cl：5.73%，N：11.24%，C：37.43%，H：3
13、.32%。3.2.2 对照品原料的红外光谱图与辉瑞的原始基准物质的红外光谱图完全一致。图 1 头孢噻呋红外光谱图3.2.3 经高效液相色谱法测定，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。3 种结构确证方法确证了所用原料为盐酸头孢噻呋。3.3 纯度测定结果3.3.1 方法 1 测得总杂质含量为 3.3%，纯度为 96.8%（见 3.1） 。3.3.2 方法 2 平均纯度为 96.3%，具体测定结果见表 2表 2 方法 2 纯度测定结果样品1234第一针纯度(%)97.0396.9496.1395.53第二针纯度(%)96.7295.6996.0895.56同时测定 sigma-
14、aldrich 公司提供的头孢噻呋试剂，测定纯度为 94.7%，与提供结果相差较大。3.3.3 测得我所对照品纯度为 99.1%，sigma-aldrich 试剂纯度为 99.9%，结果偏高。3 种纯度测定方法比较，方法 1 和方法 2 均可行，方法 3 误差太大。3.4 对照品原料的质量检验和标定结果3.4.1 分装后的对照品水分为 3.1%。3.4.2 分装后的对照品干燥失重为 3.5%。3.4.3 炽灼残渣的结果为 0.3%。3.4.4 含量测定结果3.4.1 用辉瑞公司提供的原始基准物质作比对，由 2 人测定，每人 5 个以上数据，用外标法测得我所对照品的含量结果如下，并按加权平均进行
15、统计计算，结果见表 4。表 4 外标法含量测定结果统计测定次数平均值方差权重操作者 nXS2WWX11087.390.07451341171021287.540.064318716370 总和32128080经加权平均统计计算，按湿品计，含头孢噻呋 C19H17N5O7S3为 87.5%。3.4.2 根据 WHO 对照品定值原则5，在无溯源对照品的计算下，计算一种对照品的含量是 100减去干燥失重的含量，减去无机杂质（炽灼残渣的量） ，再乘以所测定的纯度含量，作为该批对照品的含量。计算得盐酸头孢噻呋含量为 92.6%，再按元素分析测得的氯含量，折算成头孢噻呋的含量为 87.4%。与选用原始研发厂作为含量对照测得的结果一致。4 讨论4.1 稳定性试验的结果说明，头孢噻呋钠对温度、光照都比较敏感
