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1、外源外源 DNA 和质粒载体的连接反应和质粒载体的连接反应外源片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链磷酸和相邻的 3羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带 5磷酸，可生成个新的磷酸二酯链。但如果质粒已去磷酸化，则吸能形成个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的磷酸和羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌连接酶和噬菌体连接酶。实际上在有克隆用途中，噬菌体连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端片段连接起来。一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其
2、反应速度完全由互相匹配的末端的浓度决定。不论末端位于同一分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接） ，都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体。在瓜作用的底物。如果反应中浓度低，则配对的两个末端同一分子的机会较大（因为分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同分子的末端的概率） 。这倦，在浓度低时，质粒重新环化将卓有成效。如果连接反应中浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个分子的末端碰到另一分子末端的可能性也有所增大。因此在浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。Dugaiczy
3、k 等(1975;同时参见 Bethesda Res,Lab.出版的 Focus 第 2 卷，第、期合刊)从理论上探讨了浓度对连接产物性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j 和 i。j 是分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j 的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的呈随机卷曲。这样，j 与分子的长度成反比（因为越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用） ，因此 j 对给定长度的分子来说是一个常数，与深度无关。j3/(3lb0)3/2 其中 l 是长度，以cm 计，b 是随机卷曲的区段的长度。b 的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响
4、的刚度。i 是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链 dna 而言，i=2NoMx10-3 末端/ml 这里o 是阿佛伽德罗常数，是的摩尔浓度（单位：mol/L） 。理论上，当 j=i 时，给定分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当 ji 时，有利于重新环化；当 ij，则有利于产生多联体。图 1.9 显示了区段的大小与连接反应混合物中 j:i 之比分别为 0.5、1、2 和 5 时所需浓度之间关系（ugaiczyk 等， 1985） 。 现在考虑如下的连接
5、反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源片段。对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组基因组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响， 而且还受质粒和外源末端的相对浓度的影响。当 i 是 j 的倍（即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）外源末端浓度的倍时，有效重组体的产量可达到最大。这些条什下，连接反应终产物的大约 40都是由单体质粒与外源所形成的嵌合体。当连接混合物中线瘃质粒的量恒定（j:i=3）而带匹配末端的外源的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。涉及带粘端的线状磷酸化质粒的连接反应应包含：）足量的载体，以满足 j:i1
6、和 j:i3。对一个职 pUC18 一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体为 20-60g/ml。）未端浓度等于或稍高于载体的外源，如外源浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。 (二）粘端连接）用适当的限制酶消化质粒和外源。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化，然后用 TE(pH7.6)溶液使其浓度为 100/ml。）按如下所述设立连接反应混合物：a将 0.1
7、l 载体转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源。b加水至 7.5l，于 45加温分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到。c加入：10xT4 噬菌体连接酶缓冲液 l噬菌体连接酶 0.1Weiss 单位mmol/L ATP 1l于 16温育小时10xT4 噬菌体连接酶缓冲液200mmol/L 同 Tris.Cl(pH7.6)50mmol/K MgCl250mmol/L 二硫苏糖醇500g/ml 牛血清白蛋白（组分.Sigma 产品） （可用可不用）该缓训液应分装成小份，贮存于20。另外，再设立两个对照反应，其中含有（）只有质粒载体；（）只有外源片段。如果外源量不足，每个连接反应可用 50-1
8、00ng 质粒，并尽可能多加外源，同时保持连接反应体积不超过 10l。可用至少种不同方法来测定噬菌体连接酶的活性。大多数制造厂商（除 New England Biolabs 公司外）现在都用 Weiss 等，1968)对该酶进行标化。个 Weiss 单位是指在 37下 20 分钏内催化mmol32P 从焦磷酸根置换到,-32PATP 所需酶时，个 Weiss 单位相当于 0.2 个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich 和 Lehman,1970)或者 60 个粘端单位（如ew England Biolabs 公司所定义）。因此，0.015eiss 单位的噬菌体连接酶在 16下 30
9、 分钟内可使 50的 噬菌体 Hind片段（5g）得以连接。在本书中，噬菌体连接酶一律用 Weiss 单位表示。par 目前提供的噬菌体连接酶均为浓溶液（1-5 单位/l） ，可用 20mmol/L Tris.Cl (pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L 二硫苏糖醇、500g/ml 牛血清白蛋白、50甘稀释成 100单位/ml 的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的噬体连接酶于-20保存个月可保持稳定。）每个样品各取l 转化大肠杆菌感受态细胞。 （三）平端连接噬菌体连接酶不同于大肠杆菌连接酶，它可以催化平端片段的连接（Sgaramella 和 Khorana,1972;
10、Sgaramella 和 Ehrlich,1978） ，由于很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下个条件：）低浓度（0.5mmol/L）的 ATP(Ferretti 和 Sgaranekka,1981） 。）不存在亚精胺一类的多胺。）极高浓度的连接酶（50Weiss 单位ml） 。）高浓度的平端。凝聚剂在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer 和 Zimmerman,1983; Zimmerman 和 Pheiffer,1983;Zimme
11、rmanT arrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche 和 Howard- Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端的总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：）它们可使平端的连接速率加大个数量级，因此可使连接反应在酶浓度不高的条件下进行。）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的浓度下，所有的产物也将是线状多聚体。par 在设立含凝聚剂的连接反应时，下列资料可供参考。（）聚乙二醇（PEG8000）用去离子水配制的8000 贮存液（40）分装成小份，冰冻保存，但加入
12、连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含 15 PEG 8000 的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。除 PEG 800 和噬菌体连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于混合，然后加适当体积的 PEG 8000（处于室温） ，混匀，加酶后于 20进行温育。）连接混合物中含 0.5mmol/L ATP 和 5mmol/L MgCl2 时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至 ATP 浓度略有增加或gCl2 浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer 和Zimmerman,1983） 。）浓度为 15的 PEG 8000 可刺激带粘端的分子的连接效率提高至原来的 10-1
13、00 倍，反应的主产物是串联的多联体。）PEG 8000 可刺激短至个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。（）氯化六氨合高钴）氯化六氨合高钴可用水配成 10mmol/L 贮存液贮存于-20，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为 1.0- 1.5mol/L 时，其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的 50W 部，但只能使端连接的效率提高到原来的倍（Rusche 和 Howard-Flanders,1985） 。）在单价阳离子（30mmol/L KCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的
14、分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状将点尽优势。）与 8000 不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。第一节 概 述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的 DNA 片段(10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒 DNA 和目的 DNA 片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源 DNA 的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源 DNA 片段和载体 DNA 的浓度比
15、例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如 互补现象等来鉴别重组子和非重组子。外源 DNA 片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种： 1、带有非互补突出端的片段 用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的 DNA 片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源 DNA 片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在 PCR 扩增时，在 DNA 片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。2、带有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。 由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体 DNA 均可能发生自身环化
