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1、免疫组织化学免疫组织化学免疫组织化学免疫组织化学前言前言前言前言免疫组织化学（免疫组织化学（ImmunohistochemistryImmunohistochemistry）又称免疫细胞化学。又称免疫细胞化学。它它 是组织化学的分支，是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。位检测技术。1 1发展简史发展简史发展简史发展简史19411941年年 Coons Coons 首先用荧光素标记抗体首先用荧光素标记抗体检检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。测肺组织内的
2、肺炎双球菌获得成功。 6060年代年代 NakaneNakane建立酶标抗体技术建立酶标抗体技术铁铁蛋白标记蛋白标记AbAb技术。技术。 7070年代年代 Stemberger Stemberger 改良上述技术，建立改良上述技术，建立辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶抗体过氧化物酶（抗体过氧化物酶（PAPPAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。生物秀-专心做生物 8080年代年代 Hsu Hsu 等建立了抗生物素等建立了抗生物素生素（生素（ABCABC）法之后，免疫金法之后，免疫金银染色法、半抗原标记法、银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。免疫电镜技
3、术相继问世。 9090年代年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。胞化学分类方法迅速发展。20002000年年 各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生个学科，是目前生 命科学工作者应命科学工作者应 该掌握的基该掌握的基本技术之一。本技术之一。生物秀-专心做生物 2 2免疫组织化学的技术分类免疫组织化学的技术分类免疫组织化学的技术
4、分类免疫组织化学的技术分类（1 1）根据染色方式分成：）根据染色方式分成： 贴片染色贴片染色 漂浮染色漂浮染色（2 2）根据）根据AgAgAbAb结合方式分成：结合方式分成： 直接法直接法 间接法间接法 多层法多层法生物秀-专心做生物 （3 3）按标记物的性质分成：）按标记物的性质分成： 免疫荧光技术（免疫荧光法）免疫荧光技术（免疫荧光法） 免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PADPAD法、法、 ABCABC法）法） 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白染色法、蛋白A A金法）金法）3 3标记物标记物标记物标记物（1 1）必
5、要性：组织细胞内必要性：组织细胞内AgAgAbAb结合反应一结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。具有可视性标记物。生物秀-专心做生物 （2 2）常用标记物）常用标记物 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（素（Fluorescein isothiocyanateFluorescein isothiocyanate ，FITCFITC） 荧光显微镜下呈绿色荧光荧光显微镜下呈绿色荧光四乙基罗达明（四乙基罗达明（rhorhodamine damine RB200RB200）荧光显微镜下发橙红色荧光荧光显微镜下发
6、橙红色荧光 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 生物素：（生物素：（BiotinBiotin） 铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。其他：如同位素（因涉及污染和防护其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）难一般不用）4 4应用应用应用应用凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如 肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、 表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显 示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应
7、用。最近几年，分子生物学研究异常活跃，用。最近几年，分子生物学研究异常活跃， 但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学 方法对所研究的大分子分子进行定位，进而方法对所研究的大分子分子进行定位，进而 深入研究其功能。深入研究其功能。生物秀-专心做生物 一、免疫组织化学技术一、免疫组织化学技术一、免疫组织化学技术一、免疫组织化学技术（一）染色方法（一）染色方法（一）染色方法（一）染色方法1 1直接法直接法直接法直接法荧光素直接标记特异性抗体（荧光素直接标记特异性抗体（抗）抗）上，标记抗体与抗原结合（在切片上）上，标记抗体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察检测
8、抗原。荧光显微镜下观察检测抗原。 酶标抗体要显示后镜检。酶标抗体要显示后镜检。生物秀-专心做生物 直接法优点：简单，时间短，特异性强。直接法优点：简单，时间短，特异性强。 缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济）。缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济）。 应用：基本不用了！应用：基本不用了！生物秀-专心做生物 2 2间接法间接法间接法间接法 荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的物的 IgGIgG抗体）。抗体）。显色后镜检显色后镜检 特点：特点：较直接法灵敏，可标记一种抗体较直接法灵敏，可标记一种抗体鉴定多种抗原。鉴定多种抗原。生物秀-专心做生物 3 3
9、非标记非标记非标记非标记AbAb桥法：桥法：桥法：桥法： “ “桥法桥法” ”是酶标记抗体的改进，经过三次抗是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，体， 其二抗为未标记桥抗体。其二抗为未标记桥抗体。 （1 1）单桥法）单桥法）单桥法）单桥法生物秀-专心做生物 生物秀-专心做生物 (2)(2)双桥法双桥法双桥法双桥法在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，可增大染色强度。可增大染色强度。 特别提示：注意动物种属关系特别提示：注意动物种属关系4 4PAPPAP法（过氧化物酶法（过氧化物酶法（过氧化物酶法（过氧化物酶抗过氧化物酶法抗过氧化物酶法抗过氧化物酶法抗过氧化物酶法P
10、eroxidasePeroxidase antiantiperoxidaseperoxidase methodmethod， PAPPAP法）法） 是桥法的改良，既先形成是桥法的改良，既先形成PAPPAP复合物抗复合物抗原原抗体抗体抗抗IgGIgG抗体抗体PAPPAP复合物。复合物。生物秀-专心做生物 生物秀-专心做生物 该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染 标本可长期保存。标本可长期保存。标本可长期保存。标本可长期保存。5 5ABCABC法（亲和素法（亲和素法（亲和素法（亲和素
11、生物素生物素生物素生物素过氧化物酶复过氧化物酶复过氧化物酶复过氧化物酶复合物法，合物法，合物法，合物法，AvidinAvidinbiotinbiotinperoxidase peroxidase Complex methodComplex method，ABCABC法）法）法）法）AvidinAvidin： 亲和素，一种糖蛋白，其上有亲和素，一种糖蛋白，其上有4 4个个与生物素相结合的位点。与生物素相结合的位点。Biotin Biotin ： 生物素生物素维生素维生素H H，两者亲和力巨两者亲和力巨大，牢不可破。大，牢不可破。生物秀-专心做生物 （1 1）ABCABC复合物的制备：复合物的制备
12、：ABCABC法与法与法与法与PAPPAP法的区别是：法的区别是：法的区别是：法的区别是：以以ABCABC复合物代复合物代 替替PAPPAP复合物。复合物。生物秀-专心做生物 （2 2）ABCABC法反应原理法反应原理法反应原理法反应原理生物秀-专心做生物 6 6SPSP或或或或SAPSAP法（过氧化物酶标记的链霉卵法（过氧化物酶标记的链霉卵法（过氧化物酶标记的链霉卵法（过氧化物酶标记的链霉卵 白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染 色）色）色）色）StreptavidinStreptavidin
13、/ /peroxidaseperoxidase or or streptastrepta- - vidinvidin/alkaline/alkaline phosphatasephosphatase） 该法是该法是ABCABC法基础上的进一步改良，使卵白法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合合PO PO 。它有它有4 4个亚基可与生物素结合，灵敏特异，个亚基可与生物素结合，灵敏特异， 背景低，成本低。背景低，成本低。生物秀-专心做生物 现在还有现在还有plusplus盒。优点是：更简便，放大盒。优点是：更简便，放大 倍数，等电点中
14、性更适合组织。分子量倍数，等电点中性更适合组织。分子量 小，穿透力，原理保密。小，穿透力，原理保密。7 7蛋白蛋白蛋白蛋白A A金法金法金法金法（ProteinProteinA gold methodA gold method） 多用于电镜多用于电镜8 8双重组化染色法双重组化染色法双重组化染色法双重组化染色法应用双重免疫组织化学激素可在同一张切应用双重免疫组织化学激素可在同一张切片，同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不片，同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不同的抗原。同的抗原。生物秀-专心做生物 9 9免疫金免疫金免疫金免疫金银染色法银染色法银染色法银染色法（ImmunogoldImmuno
15、goldsilver staining IGSSsilver staining IGSS）（二）固定二）固定二）固定二）固定见前述见前述见前述见前述注意事项：注意事项：注意事项：注意事项：1 1固定剂的选择：因组织而不同，注意质量和固定剂的选择：因组织而不同，注意质量和性能。性能。2 2固定方式的选择：固定方式的选择： 浸渍固定（参考文献）浸渍固定（参考文献） 灌注固定（灌注固定（+ +后固定）后固定） 蒸汽固定蒸汽固定生物秀-专心做生物 （三）免疫组化染色步骤（以（三）免疫组化染色步骤（以（三）免疫组化染色步骤（以（三）免疫组化染色步骤（以ABCABCABCABC法为例）法为例）法为例）法为例）1 1切片脱蜡入水，入
