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1、1基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外体外 DNADNA 重组和转基因技术重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在 DNADNA分子水平分子水平上进行设计和施工的，又叫做 DNADNA 重组技术重组技术。 （一）基因工程的基本工具1.“分子手术刀”限制性核酸内切酶（限制酶）限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链 DNA 分子的某种特定特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定特定部位的两个核苷
2、酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开，因此具有专一专一性。（3）结果：经限制酶切割产生的 DNA 片段末端通常有两种形式：黏性末端黏性末端和平末端平末端。2.“分子缝合针”DNADNA 连接酶连接酶(1)两种 DNA 连接酶（EcoliDNA 连接酶和 T4-DNA 连接酶）的比较：相同点：都缝合磷酸二酯磷酸二酯键。区别：EcoliDNA 连接酶来源于 T T4 4噬菌体噬菌体，只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而 T4DNA 连接酶能缝合两种末端两种末端，但连接平末端的之间的效率较低低。(2)与 DNA 聚合酶作用的异同:DNA 聚合酶只能将单个核苷酸单个核
3、苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA 连接酶是连接两个两个 DNADNA 片段片段的末端，形成磷酸二酯键。3.“分子运输车”载体载体（1）载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存能在受体细胞中复制并稳定保存。具有一至多个限制酶切点，供外源具有一至多个限制酶切点，供外源 DNADNA 片段插入片段插入。具有标记基因，供重组具有标记基因，供重组 DNADNA 的鉴定和选择的鉴定和选择。（2）最常用的载体是质粒质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外细菌染色体之外，并具有，并具有自自我复制能力我复制能力的双链的双链环状环状 DNADNA
4、分子分子。（3）其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒噬菌体的衍生物、动植物病毒(二)基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取目的基因的获取1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因 。2.原核基因采取直接分离直接分离获得，真核基因是人工合成人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录反转录法法_和化学合成法化学合成法_。3.PCR 技术扩增目的基因（1）原理：DNADNA 双链复制双链复制（2）过程：第一步：加热至 9095DNADNA 解链解链；第二步：冷却到 5560，引物结合到互补引物结合到互补DNADNA 链链；第三步：加热至 7075，热稳定热稳定 DNADN
5、A 聚合酶从引物起始互补链的合成聚合酶从引物起始互补链的合成。2第二步：基因表达载体的构建基因表达载体的构建1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，并且可以遗传至下一代遗传至下一代，使目的基因能够表达和表达和发挥作用发挥作用。2.组成：目的基因目的基因启动子启动子终止子终止子标记基因标记基因（1）启动子：是一段有特殊结构的 DNADNA 片段片段，位于基因的首端首端，是 RNARNA 聚合酶聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出转录出 mRNAmRNA，最终获得所需的蛋白质蛋白质。（2）终止子：也是一段有特殊结构的 DNADNA 片段片段 ，位于基因的尾端尾端。（3）标记基因的作用
6、：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细含有目的基因的细胞胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因抗生素基因。第三步：将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞_ _1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法农杆菌转化法，其次还有 基因枪法基因枪法和 花粉管花粉管通道法通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵受精卵。将目
7、的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗传物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少质相对较少 ，最常用的原核细胞是 大肠杆菌大肠杆菌 ，其转化方法是：先用 CaCa2+2+ 处理细胞，使其成为 感受态细胞感受态细胞 ，再将 重组表达载体重组表达载体 DNADNA 分子分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收 DNA 分子，完成转化过程。3.重组细胞导入受体细胞后，筛选 含含有有基基因因表表达达载载体体受受体体细细胞胞 的依据是标标记记基基因因是是否否表表达达。第四步：目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达1.首先要检测 转基因生物的
8、染色体转基因生物的染色体 DNADNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因，方法是采用 DNADNA 分子杂交技分子杂交技术术。2.要检测 目的基因是否转录出了目的基因是否转录出了 mRNAmRNA，方法是采用 用标记的目的基因作探针与用标记的目的基因作探针与 mRNAmRNA 杂交杂交。3.最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质蛋白质，用相应的 抗抗体体进行抗原抗体杂交抗原抗体杂交。4.有时还需进行 个体生物学水平个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。 （三）基因工程的应用1.植物基
9、因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。2.动物基因工程：提提高高动动物物生生长长速速度度、改改善善畜畜产产品品品品质质、用用转转基基因因动动物物生生产产药药物物。3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。 （四）蛋白质工程的概念3蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因基因修饰或基因合成合成，对现有蛋白质进行改造改造，或制造一种新的蛋白质新的蛋白质，以满足
10、人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在自然界已存在的蛋白质）转录转录 翻译翻译 专题专题 2 2 细胞工程细胞工程（一）植物细胞工程 1.理论基础（原理）：细胞全能性细胞全能性全能性表达的难易程度：受精卵生殖细胞干细胞体细胞受精卵生殖细胞干细胞体细胞；植物细胞动物细胞植物细胞动物细胞2.植物组织培养技术（1）过程：离体离体的植物器官、组织或细胞 愈伤组织愈伤组织 试管苗 植物体（2）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。（3）地位：是培育转基因植物转基因植物、植物体细胞
11、杂交植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。3.植物体细胞杂交技术（1）过程：（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）作为诱导剂。（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。克服了远缘杂交不亲和的障碍。（二）动物细胞工程1. 动物细胞培养4（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织组织，将它分散成单个细胞单个细胞，然后放在适宜的培养基培养基中，让这些细胞生长和繁殖生长和繁殖。（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）剪碎用胰蛋白酶或胶原蛋白酶胰
12、蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞单个细胞制成细胞悬液细胞悬液转入培养瓶中进行原代原代培养贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代传代培养。（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制细胞的接触抑制。（4）动物细胞培养需要满足以下条件无菌、无毒的环境无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积
13、累对细胞自身造成危害代谢产物积累对细胞自身造成危害。营养营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血清、血浆血浆等天然成分。温度温度：适宜温度：哺乳动物多是 36.536.50.50.5；pH：7.27.27.47.4。气体环境气体环境：95%空空气气5%C CO O2 2。O2是细细胞胞代代谢谢所必需的，CO2的主要作用是维维持持培培养养液液的的p pH H。（5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。研究的各种细胞。2.动物体细胞核移植技术和克隆
14、动物（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞体细胞核移植（比较难）。（2）选用去核卵卵( (母母) )细胞细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营细胞质多，营养丰富养丰富。（3）体细胞核移植的大致过程是：（右图）（右图）核移植核移植胚胎移植胚胎移植5（4）体细胞核移植技术的应用：加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育； 保护濒危物种，增大存活数量；保护濒危物种，增大存活数量；生产珍贵的医用蛋白；生产珍贵的医用蛋白； 作为异种移植的供体；作为异种移植的供体；用于组织器官的移植等用于组织器官的移植等。（5）体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康健康问题、表现出遗传和生理遗传和生理缺陷等。3.动物细胞融合（1）动物细胞融合也称细胞杂交细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞杂交细胞。（2）
