《透明质酸的制备》由会员分享,可在线阅读,更多相关《透明质酸的制备(9页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、 透明质酸的生产工艺透明质酸(HA)的生产工艺主要分为二大类,以动物组织 为原料的提取法和细菌发酵法。透明质酸在动物组织中的分布 较为广泛,几乎所有的动物组织中均含有透明质酸,只是含量 不同。已从下列组织中分离出了透明质酸:结缔组织、脐带、 皮肤、人血清、鸡冠、关节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、人尿、 鸡胚、兔卵细胞、动脉和静脉等,但考虑到原料透明质酸含量 的高低、数量的多少和易于取得的程度等成本因素,能够用于 生产的原料主要为鸡冠、人脐带和动物眼球。细菌发酵法是利 用某些种属的链球菌,在生长繁殖过程中,向胞外分泌以透明 质酸为主要成分的荚膜。细菌发酵法与动物组织提法相比,具 有生产规模不受动物原
2、料限制,发酵液中透明质酸以游离状态 存在,易于分离纯化,成本低,易于形成规模化工业生产,无 动物来源的致病病毒污染的危险等优点。透明质酸无种属差异, 不同动物组织提取的及不同菌种发酵生产的透明质酸,在化学 本质和分子结构上是一致的,只是相对分子质量(r)有差 别。 1、以雄鸡冠(roostercomb)为原料的生产工艺 (一) 、工艺路线:(二) 、工艺流程 1提取冻鸡冠解冻后,用绞肉机绞碎,加适量水用胶体磨磨 成糊状,按每 1kg 鸡冠加水 8L,加氯化钠 80g,搅拌加热至 90,保温 10min,冷却至 50,用 1mol/L 氢氧化钠液调 pH8.59.0,加入适量胰酶,4550保温酶
3、解 57h,酶解过程中 维持 pH8.59.0。 2过滤将酶解提取液用滤布加硅藻土加压过滤,得澄清滤液。3.乙醇沉淀和粗品干燥取滤液,调 pH6.06.5,将滤液加到 3 倍体 积的 95%乙醇中,反复倾倒 3 次,待纤维状沉淀充分上浮后,取出 沉淀,用适量乙醇脱水 35 次,放入有五氧化二磷的真空干燥器 内干燥,得透明质酸中间品。 4氯仿处理将透明质酸中间品溶于 0.1mol/L 氯化钠溶液中,溶 解浓度为 0.3%,溶解过程中加少量氯仿防腐。溶解后,调 pH4.55.0,加入等体积的氯仿搅拌处理 2 次,静置分出水相。 5酶解将水相用稀氢氧化钠溶液调 pH7.5,加入适量链霉蛋白 酶,37
4、酶解 24h。 6络合沉淀酶解结束后,向酶解液中加入同体积的 1%氯化 十六烷基吡啶(CPC)溶液,静置,收集 HA-CPC 络合沉淀。7解离将 HA-CPC 络合沉淀加入 0.4mol/L 氯化钠溶液中,搅 拌解离 510h。 8过滤解离液先用硅藻土过滤至清,再用 0.2m 微孔滤膜精 滤。 9纯沉淀、真空干燥将滤液加至 3 倍体积的 95%乙醇中,反 复倾倒 3 次,取出纤维状 HA 沉淀,脱水,五氧化二磷真空干 燥,得 HA 精品。 (三)工艺说明与讨论 1对原料的预处理,鸡冠应洗净后冷冻储藏。也可用丙酮脱 水处理或储存,这样可除去大部分脂肪等杂质,以利于后面的 分离纯化,但成本加大。
5、2鸡冠绞碎后用胶体磨处理时,注意不要磨得太细,以减少 机械剪切力对透明质酸的降解。磨成糊状后,可先用水提取, 过滤除去鸡冠残渣得提取液,然后进行酶解除蛋白质;也可将 水提取和蛋白酶水解同时进行。后者的提取效率高,几乎达到 完全提取,但提取液中的杂质含量也较高。提取时,可在水中 加入 1%的氯化钠。加热至 90可对原料有一定灭菌作用,并使蛋白质热变性,易被蛋白酶水解。所用的蛋白水解酶为胰酶、 木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶等,不可 用胃蛋白酶,因胃蛋白酶的最适 pH 值太低,易导致透明质酸 的酸水解。公鸡冠中的透明质酸以与蛋白质结合状态存在,酶 解的另一重要作用是切断透明质酸与蛋
6、白质分子的结合。提取 和酶解时,应注意防腐。 3透明质酸的提取液粘度较大,过滤速度较慢,可采用先粗 滤后精滤,并加纸浆、硅藻土或活性炭助滤。 4醇沉淀是分离提纯透明质酸、肝素、硫酸软骨素等粘多糖 最常用的方法之一,在制备过程中,可多次重复使用,类似于 重结晶的作用,每次醇沉淀操作,都使透明质酸的纯度有所提 高。不同最终浓度的乙醇沉淀操作还可对不同r 的透明质酸 进行分级分离,在较低乙醇浓度下,低r 的透明质酸不易被 沉淀出来,r 越高,越容易被沉淀。在从水溶液中用甲醇或 乙醇沉淀透明质酸或其它粘多糖时,必须有盐的存在,一般为 1%左右的氯化钠。沉淀形态有纤维状和无定型粉末状两种形 态,纤维状透
7、明质酸容易制备,形态疏松,易于脱水和真空干燥,缺 点是使用时,溶解速度慢,若在常温下溶解成 1%的水溶液, 需要 37d。制备无定型粉末状沉淀,需控制料液的盐浓度、 料液和乙醇的混合速度及搅拌速度等诸多因素,工艺较复杂, 但粉末状透明质酸溶解速度快,使用方便。 5第一次乙醇沉淀、脱水、真空干燥所得透明质酸产品,可 作为化妆品用保湿剂。6上述产品透明质酸进行进一步精制时,可以使用干燥的 产品,也可使用乙醇沉淀后未干燥的产品,这样可以缩短生产 周期。 7氯仿可使蛋白变性沉淀,利用此作用可除去一部分蛋白质 杂质。氯仿处理的另一个重要的作用,是除去致炎物质。如细 菌内毒素是一种脂多糖(lipopoly
8、saccharide) ,其分子兼具脂 溶性和水溶性,在进行氯仿处理时,聚集在氯仿和水的界面, 利用这一性质可除去细菌内毒素。另外,加快搅拌速度,可提高氯仿在水中的分散度,极大地扩大氯仿和水的界面面积,提 高去除细菌内毒素等致炎物质的效率。可反复多次进行氯仿处 理。8在精制过程中,再一次使用蛋白水解酶进行酶解除蛋白 质时。应选用活性较高的酶,因为酶本身是一种蛋白质,在保 证酶的总活性单位的前提下,酶的总重量越少越好,这样可减 少产品中的蛋白质杂质。 9CPC 络合沉淀与解离步骤是分离提纯酸性粘多糖(透明质 酸、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等)常用的方法之一,特 点是纯化效率高、回收率高,可以从
9、很低浓度的溶液中将透明 质酸或其它酸性粘多糖沉淀出来。原理是,CPC 为季铵盐, 在水溶液中带正电荷;透明质酸或其它酸性粘多糖,在水溶液 中带负电荷;在低盐浓度下,透明质酸与 CPC 络合沉淀,在 高盐浓度下,HA-CPC 络合物解离溶解。利用这一性质,可除 去不能与 CPC 络合并沉淀的杂质。透明质酸与其它酸性粘多 糖聚阴离子的电荷密度不同,与 CPC 络合生成沉淀时盐浓度 可以不同,络合沉淀物解离所需的最低盐浓度也不同。使用 CPC 络合沉淀法,可实现透明质酸与肝素、硫酸软骨素等酸 性粘多糖的分离。此原理与离子交换法有类似之处。 除 CPC 外,也可使用溴化十六烷基吡啶(CPB) ,十六烷
10、基三甲 基溴化铵(CTAB)等其它长链季铵盐。 10透明质酸在干燥之前要充分脱水,否则有机溶剂挥发后, 残存的水分过多,会导致被干燥的产品粘结,不易于干燥,干 燥时间延长,干燥后产品变硬、变黄。脱水所用的溶剂为 95%乙 醇、无水乙醇、丙酮和甲醇,丙酮的沸点低,挥发性高,用丙 酮脱水易于干燥,但干燥后的产品带有特殊气味。干燥的产品 量较少时,可采用静止状态下,加五氧化二磷进行常温真空干 燥;产品量较多时,可采用动态的真空干燥,温度控制在 5065,不用五氧化二磷。2、以人脐带(humanumbilicalcord)为原料的生产工艺(一) 、工艺路线:(二) 、工艺过程 1提取丙酮脱水脐带在提取
11、前应通风挥发干丙酮,剪碎,加 入蒸馏水中浸泡 24h,用高速组织捣碎机打成细小碎块。用蒸 馏水反复提取 4 次,第一次加水量为脱水脐带 10 倍,之后三 次适量递减。合并提取液过滤得滤液。 2氯仿处理滤液中加入 10%量的氯化钠,搅拌使溶解。用稀 盐酸调 pH5.0,加入等体积的氯仿搅拌处理,静置,待分层后分 出水相。同样再加氯仿处理一次,分出水相。 3酶解用稀氢氧化钠调 pH7.5,按水相体积加入 0.4%量的链 霉蛋白酶,置 37保温酶解 24h。4氯仿处理再用氯仿处理 23 次,分出水相。 5乙醇沉淀加入 3 倍体积的 95%乙醇沉淀出透明质酸。取出 沉淀,重新溶解于 0.1mol/L
12、的氯化钠溶液中,再次用 3 倍体积 95%乙醇沉淀。 6脱水干燥分别用 95%乙醇、丙酮脱水,五氧化二磷真空干 燥得透明质酸精品。 (三)工艺说明与讨论 1对原料预处理,新生儿脐带剪下后,应尽量挤出里面血管 中存留的血液,再放入丙酮中脱水保存。若在提取前发现脱水 脐带血管中残存较多血凝快,应将血管剥离,以减少提取和纯 化过程中的血色素污染。否则,产品带有颜色。 2本工艺尽量采用温和条件,避免可能使透明质酸大分子降 解的处理,如加热、强酸、强碱等。 3实验发现,在高盐浓度下,有机溶剂可使大部分蛋白质变 性,或被盐析沉淀出,或在乙醇沉淀后不再溶于水,这样可使 提取液得到明显的纯化。 4本工艺未使用
13、氯化十六烷基吡啶(CPC)络合沉淀法进行 纯化,所得产品纯度较低,可能混有其它多糖,蛋白质杂质含 量也较高(0.6%0.8%),但由于所用的原料为人脐带,所得透 明质酸精品作为眼科手术用粘弹辅助剂时,引起抗原反应的可 能性较小。三、以动物眼玻璃体为原料的制备工艺 (一)工艺路线(二)工艺过程 1提取将冷冻的牛、猪或羊眼球解冻,剥出玻璃体,融化后 离心,分出上清,加入 1.5 倍体积的丙酮沉淀。8h 后离心,所 得沉淀加入到 1mol/L 氯化钠溶液中,搅拌提取 4h,离心。 2除蛋白质上清液在低温下加入冷的 5%三氯乙酸,搅匀, 立即离心分出上清液,用 5mol/L 氢氧化钠溶液调 pH 值至
14、中 性。 3粗品沉淀将中性上清液倒入 2 倍体积 95%乙醇中,分出 沉淀。 4溶解、吸附除杂质将沉淀溶于 0.1mol/L 氯化钠溶液中,加 入处理好的漂白土搅拌吸附 2h,离心收集上清液。 5络合沉淀向上清夜内加入等体积的 1%CPB 溶液,得 HA- CPB 沉淀。放置 12h 后离心,收集沉淀。 6解离沉淀洗涤后于 0.4mol/L 氯化钠溶液中解离 4h,抽滤。7沉淀、干燥:将滤液倒入 3 倍体积 95%乙醇中,分出沉淀。 沉淀经乙醇、丙酮脱水,放于有五氧化二磷的真空干燥器内干 燥,得玻璃酸钠精品。 (三)工艺说明与讨论 1以动物眼玻璃体为原料制得的透明质酸,其质量较以雄鸡 冠和人脐
15、带为原料者差,相对分子质量 Mr 较小,一般不适于 作注射剂使用。 2吸附除杂质步骤,尚可选用类似吸附剂。天然矿物质吸附 剂常因生产厂或同一厂批次不同在吸附性能上有差异,其预处 理方法也很重要,要根据实际情况实验研究来确定具体操作方 法。 3CPB 与 CPC 的性能基本相同,两者在透明质酸的 生产中可相互代用。四、细菌发酵法生产工艺 (一)工艺路线(二)工艺过程 1)摇瓶种子液的培养取斜面菌种,接种于装有灭菌培养液 400ml 的 1L 锥形瓶中,37培养 1216h,光镜观察菌体生长 良好,无杂菌污染,即可接种于种子罐中。培养液配方:蛋白 胨 10g、牛肉浸膏 5g、酵母膏 5g、葡萄糖
16、5g、磷酸氢二钾 2g、硫酸镁 0.3g,加水溶解至 1L,115灭菌 30min。 2)种子罐种子液的培养按摇瓶种子液的配方配制培养液 100L,加入种子罐中,通蒸汽加热,115灭菌 30min。冷却 至 37,用火焰接种法,将摇瓶种子液接种于种子罐中,通 气量 50L/min,搅拌 120rpm,37培养 1216h。光镜观察菌 体生长良好,无杂菌污染,即可待接种于发酵罐中。 3)发酵按摇瓶种子液配方,将葡萄糖含量提高到 5%,配制 发酵培养液 1000L,加入 1.4m3 发酵罐中,通入蒸汽加热,115 灭菌 30min。冷却至 37后,将种子罐中的种子液通过移种 管道移至发酵罐中,维持通气量 500600L/min,搅拌转速 120rpm,37发酵 4046h。在发酵过程中,发酵液的 p