《实验四植物DNA的大量提取与Southern杂交》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验四植物DNA的大量提取与Southern杂交（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1 实验四 植物 DNA 的大量提取与 Southern 杂交第一天一、植物 DNA 的大量提取CTAB法：CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵 ), 是一种阳离子去污剂， 具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。注:CTAB溶液在低于 15 时会形成沉淀析出, 因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于 15。
2、 Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。EDTA 螯合 Mg2+或 Mn2+离子, 抑制 DNase活性。NaCl 提供一个高盐环境，使DNA 充分溶解，存在于液相中。- 巯基乙醇是抗氧化剂 , 有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。PVP( 聚乙烯吡咯烷酮 )是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA 中酚的污染，同时它也能和多糖结合，有效去除多糖 。材料：转基因植株步骤：1) 取 20 mL CTAB提起液于 50 mL离心管中， 65预热。2 2) 取 5 克新鲜幼嫩叶片，加液氮磨成粉末，转入盛有预热提起液的离心管内，迅速搅
3、拌均匀。3) 于 65水浴提取 1 h。冷却至室温。4) 加等体积氯仿 - 异戊醇（ 241） ，充分混合均匀。5) 离心（ 4000r/min ，15 分钟） 。6) 上清液用等体积氯仿 - 异戊醇抽提 1 次（4000 rpm，15 min） 。7) 上清液中加入 2/3 体积的异丙醇，摇匀。此时应有絮状DNA出现。8) 挑出 DNA ， 置于 10 mL 离心管中。加 76乙醇浸泡 1 h 9) 离心（ 3000 g，4） 15 min10)沉淀 DNA用 76% 乙醇洗 2 次，自然晾干11)沉淀加入 5 mL 1 mol/L pH8.0 TE buffer ，5 L RNase A
4、（1.0 mg/ mL）， 56温浴至全部溶解12)加入预冷的等体积的氯仿- 异戊醇 (24：1) ，摇匀，4 C 静置10 min，离心 (3000 g, 20 min) 13)上清液加入1/10 体积 5 mol/L NaAc ，2 倍体积乙醇， -20oC放置 1 h 或过夜。14)离心(12000 g, 20 min)，沉淀用 75%洗 2 次15)转移至 95的乙醇中，浸泡5 min 3 16)将 DNA 自然晾干，溶于 1 mol/L pH8.0 的 TE溶液中，贮于 4待用。第二天二、DNA 浓度的测定及调整待 DNA 完全溶解后，用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 含量。 取 2 L
5、DNA 溶液加 98 L H2O，混合。取5L 进行琼脂糖凝胶电泳，以/Hind III为标准，凝胶扫描后估算DNA 含量。通过稀释将DNA浓度调至 250300 ng/ L 左右。三、 DNA 的酶切、电泳、 Southern转移1. 浓度调至250300 ng/L 的 DNA 用常见的限制性内切酶（EcoRI）进行酶切，取总DNA 2.5-3 g，8U 的限制性内切酶，特异的酶切缓冲液 1.7 L ， 用 ddH2O使总体积为 17 L ， 37酶切过夜。Pst /EcoR /BamH 样品编号内 切酶Buffer类型17 L反应体系中各成分用量（L ）DNA Buffer enzyme
6、RNase H2O Total 1 EcoR I 3 1.7 0.5 17 第三天4 2. 取 2 L 酶切反应混合液进行电泳检测，3. 当酶切完全后进行酶切片段的电泳分离。电泳时琼脂糖浓度为 0.8，电压 40V，待溴酚蓝指示带到达前缘后停止电泳。4. 转膜1) 用 0.2 mol/L HCl 变性 8 分钟，2) 用 0.4 mol/L NaOH 作转移液将凝胶中的酶切片段通过虹吸作用转移至 Hybond N尼龙膜上（约需 24 h） 。第四天3) 将膜用 2 SSC洗 2 次，每次 5 min，置于干净滤纸上晾干，晾干的膜于已预热至85左右的干燥箱中烘干 （约 3 h） ，或紫外照射 3
7、 min。保存于 4备用。四、Southern杂交原理North2South?生物素标记和化学发光检测Kit 采用随机引物标记法， 利用 DNA 聚合酶，以目标 DNA 为模板，在随机七核苷酸为起始引物的作用下，将生物素标记的dCTP 掺入到合成的 DNA 探针中，产生可用于Southern 或 Northern 杂交实验的高活性 DNA 探针。杂交洗膜后， DNA 上的生物素与链亲和素标记的HRP 结合，最后与 Pierce 的化学发光底物发光检测， 灵敏度可以与5 32P 相媲美。步骤：1）预杂交在 65水浴中预热杂交液，将准备好的膜置于杂交盒中，加入预热的杂交液10 mL （将膜完全淹没
8、，每平方厘米膜至少0.1ml 杂交液。除了 RNA:RNA 杂交用 65外，其他的都用55），盖好盖子，置于 55杂交箱中预杂交1 h。2）探针准备 ：A 将 1 L 生物素标记的 N4-dCTP 与 4 L 的 5 dNTP 混合物充分混合备用（总量 5 L）；B 在离心管中稀释约50 ng 线性探针模板至 12 L；C 加入 5 L 随机引物于上述离心管中，煮沸变性5 min，迅速在冰水混合物退火 5 min；D 加入 5 L N4-dCTP 与 5 dNTP 的混合物， 2.5 L 反应缓冲液，0.5 L Klenow 酶片断，混匀；E 37 孵育 60 min；F 加入 1 L EDT
9、A 以灭活 Klenow 酶活性， -20 保存备用。6 G 热变性探针： 21 L 探针煮沸变性 10 min，迅速在冰 /盐水混合物退火 5-10 min。（每毫升杂交液加1-1.5 L 探针，或探针浓度约30ng/mL 杂交液）；3）杂交 ：将标记好的探针加入杂交盒中，55杂交过夜（ 4 小时以上，过夜）。第四天4）洗膜：A 0.5严谨洗膜缓冲液配制（0.2 mL/cm2 膜）：2North2South Hybridization Stringency wash Buffer(平衡严谨洗膜缓冲液 )室温（ 25 以上）充分溶解，加入3 倍体积去离子水配置所需洗膜液；B 将膜转移到一个新的
10、杂交盒中。加入0.5严谨洗膜液（0.2 mL/cm2膜）， 55 旋转洗膜 3 次，每次 20 min。5）信号检测A 预先缓慢温浴封闭液和4 漂洗缓冲液（ 37-50 ）溶解，此 2种缓冲液可以在室温使用， 底物平衡液可以在室温使用， 要保证所有缓冲液充分溶解，没有颗粒；B 配制 1 漂洗缓冲液 120 mL（1:3 配比）；C 封闭：弃严谨洗膜液，加入封闭液（0.25 mL/cm2膜），45 振荡洗膜封闭 15 min（37-50 均可）；D 抗体稀释液配制（ 1:300）：66.7 L 稳定的链亲和素标记的HRP(SSHP) 20 mL 封闭液；7 E 抗体孵育：弃封闭液，加入20 mL
11、 抗体稀释液，室温轻柔振荡孵育 15 min；F 洗膜：用 20 mL 的 1 漂洗缓冲液淋洗杂交膜， 然后再用 20 mL漂洗缓冲液分别室温轻柔振荡漂洗4 次，每次 5 min；G 平衡：将杂交膜转移到一新的杂交盒， 用 30 mL 的底物平衡液室温轻柔振荡孵育5 min；H 底物工作液配置：North2SouthTM Luminol/Enhanser 溶液和 North2SouthTM 过氧化物酶稳定溶液 1:1 等体积混合，底物工作溶液需足够以完全覆盖杂交膜(约 0.1 mL/cm2)；注：该工作溶液在室温下至少能稳定6 h。I 底 物 孵 育 ： 把 湿 润 的 膜 放 在 一 个 干净 的 杂 交 盒 里 ， 与North2SouthTM 底物工作溶液在室温下暗室孵育5 min。确保膜被底物溶液完全淹没或覆盖；J 把湿润的膜转移到干净平整的保鲜膜上，再在上面覆盖一层保鲜膜，清除保鲜膜和杂交膜间的气泡和皱褶，吸干边缘的溶液；K 曝光：把包好的杂交膜放在凝胶成象系统里，曝光30 min，每分钟曝光 1 次。或把包好的杂交膜放在暗夹里，放上X 光片，曝光10-30 min （曝光时间长短可以稍有变化以获得理想的信号），从暗夹里取出 X 光片，进行显影和定影。
