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1、第一章第一章 核酸转导方法核酸转导方法有大量的技术和试剂用于将大分子转导至真核细胞中。这些大分子与胞内的组分反应，从而导致基因表达、蛋白质合成、细胞分化的诱导或抑制、细胞形态的改变、细胞的无限增殖或恶性转化。针对不同转染实验的各种目的和要求，没有任何一种方法或试剂对于所有的大分子转导都是最佳的。既然可以象转导蛋白质和小分子一样将 DNA，RNA 和寡聚核苷酸转导到各种细胞中，本手册将着重于如何将核酸转导至真核细胞。目前，有两种不同的方法被应用：转染在这一过程中通过生化或者物理方法将目的基因导入真核细胞中。感染通过病毒介导，用基因组中携带有克隆目的片段的病毒来感染靶细胞。通过感染转导 DNA 比
2、转染的方法更复杂。一般来说，感染步骤烦琐，时间较长，而且视所使用的病毒，还会产生生物安全性的问题。在敏感细胞系中病毒感染效率高，而在缺少病毒受体的细胞系中感染效率很低或者无感染。然而，通过转染来转导 DNA 更快，而且只需几种材料，包括含有在强启动子调控下的目的基因的质粒 DNA。由于其简便和诸多提高效率的优点，使得转染成为一种应用更为广泛的方法。核酸转染技术核酸转染技术转染技术的目的是研究真核基因的表达和调控。目前的方法包括磷酸钙共沉淀法，电穿孔法以及同 DEAE-dextran 或阳离子脂质体试剂形成复合物法。在这些不同的方法中，DNA 转导的效率，转导的机制，可重复性及使用的方便性都存在
3、差异。而且，有效的 DNA 转导会伴随某些毒性或细胞抑制，程度依赖于试剂、步骤和目的细胞的不同而不同，因此建议每种技术都应优化以得到最佳结果。下面就对转染技术做简要叙述。磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉淀将氯化钙，DNA 和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含 DNA 且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA 复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个 pH 都会导致磷酸钙转染的失败。电穿孔法电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导
4、沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。DEAE-DEAE-葡聚糖和葡聚糖和 polybrenepolybrene带正电的 DEAE-葡聚糖或 polybrene 多聚体复合物和带负电的 DNA 分子使得 DNA 可以结合在细胞表面。通过使用 DMSO 或甘油获得的渗透休克将 DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。机械法机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪
5、（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将 DNA，RNA 或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压 microprojectile 将大分子导入细胞。阳离子脂质体试剂阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约 100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到 DNA 的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA 并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的 DNA 自动结合到带正电的脂质体上，形成 DNA-阳离子脂质体复
6、合物（图图 1 1）。据称，一个约5kb 的质粒会结合 2-4 个脂质体。被俘获的 DNA 就会被导入培养的细胞。现存对 DNA 转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。图图 1.1. 阳离子脂质体介导的转染同转染方法相关的问题有：较低的 DNA 转导效率，较窄的细胞类型应用面，较差的可重复性，细胞毒性或不方便。然而阳离子脂质体介导的转染方法在多种真核细胞类型中获得了以前无法获得的，很高的转染效率，且使用简单，保证可重复的一致结果。另外，使用其他方法一般无法转染的一些细胞系已经使用阳离子脂质体成功转染。不象磷酸钙，阳离子脂质体介导的转染需要相对较少的 DNA 且不需要载体（carrier）DNA。
7、下面的章节将会介绍 Invitrogen 针对不同应用的阳离子脂质体试剂以及使用这些试剂所应该考虑的条件。InvitrogenInvitrogen 做为世界上转染试剂最主要的研发者和供应商，提供独一无二的阳离子脂质体试剂系列，可以在多种真核细胞中进行可重复的高效转染。阳离子脂质体试剂介导的 DNA 转导已经成为磷酸钙共沉淀和 DEAE-葡聚糖介导的真核细胞转染的优良替代方法（图图 2 2），也可以做为电穿孔法的简单实用的替代方法。Invitrogen 阳离子脂质体试剂家族在稳定转染、瞬时转染以及难以转染的细胞系应用中都表现出超乎寻常的效果。图图 2.2. 半乳糖苷酶（-gal）表达比较在 6
8、孔板上铺板 210 R1610 肺表皮细胞，使用磷酸钙或 LIPOFECTAMINE PLUS 转染 pCMVSPORT-gal,由剂量反应曲线取最佳点。我们的转染试剂家族我们的转染试剂家族 LIPOFECTAMINE2000提供对大多数细胞最高的转染活性在含血清时的效果无可匹敌对常用于蛋白表达的细胞系非常适合建议使用 96 孔板进行高通量应用 LIPOFECTAMINE PLUS对于多数贴壁细胞的转染效率较高使用方便，不需要对 DNA 和阳离子脂质体试剂的量进行优化同 LIPOFECTAMINE 相比，仅需要使用一半量的 DNA 和阳离子脂质体试剂LIPOFECTAMINE已证实可以对多数贴
9、壁细胞进行高效转染DMRIE-C对于悬浮细胞，如淋巴细胞的 DNA 转染表现出超乎寻常的效果建议用于 RNA 的转染OLIGOFECTAMINE专门针对寡聚核苷酸的转染CELLFECTIN在昆虫细胞的转染中表现出色LIPOFECTIN对内皮细胞的转染效率较高用于寡聚核苷酸的转染效果已证实293FECTIN专门针对 293 细胞的转染对 293 细胞的转染表现出最佳效果第二章第二章 LIPOFECTAMINELIPOFECTAMINE 20002000 试剂试剂 LIPOFECTAMINE 2000 试剂为大多数细胞（见附录 A）提供了最高的转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中
10、转入基因的酶产物活性）（图图 3 3）。当存在血清或用于进行蛋白表达的细胞系（如 COS-7，CHO 和 293）时，LIPOFECTAMINE 2000 尤为有效，效率可超过 90%。欲了解针对您的细胞类型和应用的最佳阳离子脂质体试剂的信息，您可以参阅我们网站 上 Technical Resources 部分的Transfection Collection（概述见附录 A）。图图 3.3. 使用使用 LIPOFECTAMINELIPOFECTAMINE 20002000 获得高转染效率获得高转染效率细胞在含有血清的生长培养基中铺板，第 2 天使用 LIPOFECTAMINE 2000 在
11、24 孔板中转染（BE(2)C 细胞不使用血清）pCMVSPORT-gal。加入复合物后 24 小时使用 X-gal 对细胞染色。根据LIPOFECTAMINE 2000 剂量-反应曲线确定最佳点。两个关键性特点使得 LIPOFECTAMINE 2000 试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，以及（2）转染后不需要除去 LIPOFECTAMINE 2000 试剂（见第 7 章实验步骤）。对于 96 孔板培养，不再需要提前一天进行细胞铺板，而可以直接在平板中制备复合物，然后将细胞悬浮液加入到复合物就可以了，这样进一步减少了转染时间。这种改进步骤
12、已经过 293-H，293-F，COS-7L 和 CHO 细胞的试验，同传统方法相比活性稍低（图图 4 4）。快捷的步骤和蛋白表达细胞系的高效转染使得 LIPOFECTAMINE 2000 非常适用于 96 孔板的高通量转染，比如 cDNA 文库的筛选和蛋白瞬时表达。图图 4.4. 备用转染方法和标准转染方法的比较备用转染方法和标准转染方法的比较在 96 孔板中使用 LIPOFECTAMINE 2000（1-6 列分别为 0.2l 到 1.2l）和 pCMVSPORT-gal（0.16g 到 0.32g）转染 CHO-S 细胞。24 小时使用 X-gal 对细胞染色。组 A. 转染前一天在含血
13、清的生长培养基中进行 CHO-S 细胞（2104）铺板。组 B. 转染日，将 CHO-S 细胞进行胰酶消化，计数，然后将 5104 细胞直接加入含复合物的孔中。对于大多数阳离子脂质体试剂，应优化 DNA 浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率（图图 5 5）。使用小剂量确定的优化条件可以用于进行大剂量的转染，只要根据培养板表面比例线性增加铺板细胞的数目、阳离子脂质体试剂和 DNA 量就可以了（见第 3 章表 1）。图图 5.5. LIPOFECTAMINELIPOFECTAMINE 20002000 试剂的优化试剂的优化在 96 孔板中使用含血清的生长培养基进行 293-H 细胞铺板。第
14、二天在 24 孔板中使用 pCMVSPORT-gal 和 LIPOFECTAMINE 2000 转染细胞。24 小时后使用 ONPG 分析 -gal 活性。第三章第三章 LIPOFECTAMINELIPOFECTAMINE PLUSPLUS 试剂试剂在 1993 年发明的 LIPOFECTAMINE 试剂对多种真核细胞的转染提供了一种有效的方法。在常见的细胞系，如 BHK-21 和 CHO-K1 中，90%的细胞都表达了使用 LIPOFECTAMINE 转染的报告基因质粒。但一些细胞系对于这种方法和其他转染试剂有抗性，比如人的原代成纤维细胞转染效率仅为约 5%。在 1993 年发明的 LIPO
15、FECTAMINE 试剂对多种真核细胞的转染提供了一种有效的方法。在常见的细胞系，如 BHK-21 和 CHO-K1 中，90%的细胞都表达了使用 LIPOFECTAMINE 转染的报告基因质粒。但一些细胞系对于这种方法和其他转染试剂有抗性，比如人的原代成纤维细胞转染效率仅为约 5%。图图 6.6. 使用使用 LIPOFECTAMINELIPOFECTAMINE PLUSPLUS 获得高转染效率获得高转染效率对三种难以转染的细胞进行铺板，并在第 2 天在 24 孔板中使用 LIPOFECTAMINE PLUS 或 LIPOFECTAMINE 试剂转染 pCMVSPORT-gal。24 小时后收
16、获细胞，使用 ONPG 分析 -gal 活性或固定细胞，使用 X-gal 染色以分析转染活性（每幅图下标有效率的峰值）。除了增加活性峰外，使用 LIPOFECTAMINE PLUS 试剂转染，在广谱的脂质体试剂和 DNA 浓度范围内都可以得到很高的 -gal 活性。甚至对相对较容易转染的 BHK-21 细胞也是如此（图图 7 7）。单独使用 LIPOFECTAMINE 试剂需要对阳离子脂质体和 DNA 的量进行优化以寻找获得最高活性的条件。然而，加入 PLUS 试剂后会导致在广泛条件下结果的高活性。现在，因为更广范围的活性，不需要进行细节优化就可以进行高活性转染了。Peak efficiency for BHK-21 cell transfected with LIPOFECTAMINE PLUS Reatent 图图 7.7. 转染活性的比较转染活性的比较将 BHK-21 细胞在 24 孔板中铺板，第 2 天使用不同数量的 LIPOF
