Western Blot详解及常见问题

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1、Western Blot 详解 Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已 知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的 抗体检测。该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下 Western Blot 技术。 Contents： （1） 原理 （2） 分类 i. 放射自显影 ii. 底物化学发光 ECL iii. 底物荧光 ECF iv. 底物 DAB 呈色 （3） 主要试剂 （4） 主要程序 （5） 实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题 3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5

2、. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择 7. 参照的疑问 8. 缓冲液配方的常见问题 9. 条件的摸索 10. 方法的介绍 11. 结果分析（1） 原理 与 Southern 或 Northern 杂交方法类似，但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被 检测物是蛋白质， “探针”是抗体， “显色”用标记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白质样品， 转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能 保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过

3、底物显色或放射 自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白 水平的表达。 （2） 分类 western 显色的方法主要有以下几种： i. 放射自显影 ii. 底物化学发光 ECL iii. 底物荧光 ECF iv. 底物 DAB 呈色 现常用的有底物化学发光 ECL 和底物 DAB 呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法， 目前发表文章通常是用底物化学发光 ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单， 原理如下（二抗用 HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到 HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 （3） 主要试剂 1、 丙烯酰胺和

4、N，N-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水 配制含有 29%(w/v)丙稀酰胺和 1%(w/v)N，N-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺 29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺 1g，加 H2O 至 100ml。)储于棕色瓶，4避光保存。严格 核实 PH 不得超过 7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个 月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 2、 十二烷基硫酸钠 SDS 溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O 去离子水配制，室温保存。 3、 分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris 和 4

5、8ml1mol/LHCL 混合，加水稀 释到 100ml 终体积。过滤后 40C 保存。 4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris 溶于 40mlH2O 中，用约 48ml 1mol/L HCL 调至 pH6.8 加水稀释到 100ml 终体积。过滤后 40C 保存。这两种缓冲液必须 使用 Tris 碱制备，再用 HCL 调节 PH 值，而不用 Tris.CL。 5、 TEMED 原溶液 N，N，NN四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙 稀酰胺的聚合。PH 太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰 胺聚合所

6、必须的自由基。去离子水配制数 ml，临用前配制. 6、 SDS-PAGE 加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris 缓冲液 8ml，甘油 6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇 3.2ml，0.05%溴酚蓝 1.6ml，H2O 32ml 混匀备用。按 1:1 或 1:2 比例与 蛋白质样品混合，在沸水终煮 3min 混匀后再上样，一般为 20-25ul，总蛋白量 100g。 7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g 甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至 1000ml， 得 0.25mol/L Tris-1.92mol/L 甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释

7、10 倍。 8、 转移缓冲液：配制 1L 转移缓冲液，需称取 2.9g 甘氨酸、5.8gTris 碱、0.37g SDS，并 加入 200ml 甲醇，加水至总量 1L。 9、 丽春红染液储存液：丽春红 S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 加水至 100ml 用时 上述储存液稀释 10 倍即成丽春红 S 使用液。使用后应予以废弃。 10、 脱脂奶粉 5%(w/v)。 11、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。 12、 Tris 缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。 13、 Tw

8、een20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。 14、 过氧化物酶标记的第二抗体。 15、 NBT(溶于 70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。 16、 BCIP(溶于 100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。 17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。 18、 100mmol/L NaCl。 19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。 （可以参看分子克隆）（4） 主要程序 在这主要列举了一些网站上的有关 Western Blot 的英文资料，读者可以根据自己实验室的 实际情况进行调整： Western Blot PR

9、OTOCOL：1、 Preparation of Brain Membrane Fractions for Western Blot 2、 Western Blotting 3、 Western Blots 4、 Western Blotting 5、 General Western Blot Protocol6、 Western Blot & Immunostaining 7、 Western Blot Analysis for Tissue8、 Western Blotting 9、 ECM Protocols Western Blot 10、Western Blotting Using

10、Chemilminscence 11、Far Western Blotting12、Enzyme-Assisted Immunoelectroblotitng 13、Western Trouble Shooting 14、Too Many Bands on Western Blot Tips and hints for the storage of antibodies 5） 实验常见的问题指南 根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）：1. 参考书推荐A. 对初学者看什么资料比较好？ 解答：抗体技术实验指南和 Antibodies（a laboratory manu

11、al， wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。2. 针对样品的常见问题B. 做线粒体膜 UCP2 蛋白的 Western Blot （以下简写成 Western Blot） ，提取线粒体后冻存 （未加蛋白酶抑制剂） ，用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加 到 120g，换了个 santa cloz 的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加 PMSF 行吗？解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同 时，建议检查 Western Blot 过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加 PMS

12、F 就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。C. 细胞水平要做 Western Blot，多少细胞提的蛋白够 Western Blot？ 解答：一般地 5* 106 就足够了。D. 同一样品能同时提 RNA 又提蛋白吗，这样对 Western Blot 有无影响? 解答：能，没有问题，我们做过。E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的 Western Blot 检测吗？ 解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？ 解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上 NaF 去抑制 磷酸化酶的活性。G. 我的样品的蛋白

13、含量很低，每微升不到 1 微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋 白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有 什么办法可以解决？ 解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加 510甲醇。H. 想分离的蛋白是分子量 260kd 的，SDS-PAGE 电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓 度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作 Western Blot 吗？ 解答：260kd 的蛋白不好做， 分离胶用 6， Stacking Gel 3.5。I. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能 看清

14、楚。 解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超 载 30是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的 厚度，可以试试 1.5mm 的 comb。J. 蛋白变性后可以存放多久？ 解答：80，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉 (也是被酶水解了)。K. 我所测定的蛋白分子量是 105KD，按理说分离胶应当采用 7.5%，但我所查资料却要求 分离胶和浓缩胶均采用 11的配方，不知为何？ 解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为 105的蛋白在上述两种胶的线性分辨 范围内，但需注意条带位置。L. 接下来我

15、准备采用 DAB 显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物 素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用 5的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？ 解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用代替应该好一点M. 还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？ 解答：Western Blot 一般上样 30100 微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二 抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果， 各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如

16、果抗体 好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合 Western Blot 的怎样 做也不行。所以拿到好的结果不容易。N. 做组织样品的 western 的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭 剂吗？浓度如何？效果是不是比 BSA 好一点？ 解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用 更剧 烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的 蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入和蛋白酶抑制剂 cocktail） ， 封闭剂一般 5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用也是不错的选择。O. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白 200KD，在做 western 要注意什么呢？ 解答：做 200kd 蛋白的 Western Blot 时要注意，分离胶最好选择7%的；剥胶时要小心； 转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析） 。P. 有什么方法可以提高上样量？ 解答：可以浓缩样品；