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1、第一军医大学硕士学位论文先兆子痫病理相关基因的克隆姓名：张克荣申请学位级别：硕士专业：妇产科指导教师：邢福祺;庞战军20030528英文缩写词中英文对照表( A b b r e v i a t i o nI n d e x )英文缩写英文全文中文全称P EC D N AP C RE D T Am R N AD C NI G F B PR N a s eP E GD M S OD E P C B M Eb pk bS D SM O P SI P T GP r e e c l a m p s i ac o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c l
2、 e i ca c i dp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o ne t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i dm e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i dd e c o f i ni n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o rb i n d i n gp r o t e i nr i b o n u c l e a s ep o l y e t h y l e n eg l y c o ld i
3、 m e t h y ls u l f o x i d ed i e t h y lp y r o c a r b o n a t e1 3 一m e r c a p t a e t h a n o lb a s ep a i rk i l o b a s ep a i rs o d i u md o d e c y ls u l f a t e3 一m - - m o r p h o l i n a ) p r o p a n e s u l f o n i c A c i di s o p r o p y l t h i o 1 3 一D g a l a c t o x i d eX g
4、a l5 b r o m o 一4 一c h l o r o - 3 - i n d o l y l - B - - D先兆子痫互补脱氧核糖核酸聚合酶链式反应乙二氨四乙酸信使核糖核酸核蛋白多糖胰岛素样结合蛋白核糖核酸酶聚乙二醇二甲基亚砜焦碳酸二乙酯B 一巯基乙醇碱基对于碱基对十二烷基硫酸钠3 - ( N - 吗啉代) 丙磺酸异丙基硫代一BD 一半乳糖5 - 溴一4 氯3 一吲G a l a c t o s i d e8 一D 一半乳糖苷2先兆子痫病理相关基因的克隆中文摘要目的：应用抑制性消减杂交克隆技术，初步筛选出与先兆子痫有关的高表达基因和或新基因，并进一步在大样本中观察筛选出的基因表达情况
5、，为明确先兆子痫基因学病理机制提供理论依据。方法：我们以先兆子痫胎盘和正常妊娠胎盘为研究对象，采用抑制性消减杂交技术、基因克隆等技术，筛选出与先兆子痫有关的高表达基因和戚新基因。在标本的采集上，尽量减少孕妇其它因素对该研究的影响，如标本均选取剖宫产胎盘，孕妇年龄、孕周、胎次、婚史等尽可能接近，同时排除高血压、肾脏疾病史。1 、采用一步法提取总R N A 方法，分别从先兆子痫病人和正常妊娠分娩胎盘中提取总R N A ，采用磁珠分离系统进一步分离出m R N A 。紫外分光光度计检测其浓度，测定A 2 6 0 A 2 8 0 n m 、A 2 6 0 A 2 3 0 u m 吸光度值以估计R N
6、A 样品的纯度，甲醛变性胶电泳分析R N A 的完整性：2 、采用抑制性消减杂交技术，以m R N A 为逆转录模板合成e D N A ，进行两次杂交和两次P C R 扩增，并对扩增产物、消减效率进行分析；3 、P C R 产物转入活化的J M l 0 9 大肠杆菌中，克隆并进行蓝白斑筛选，从而成功构建出消减c D N A 文库；4 、对构建的先兆子痫胎盘消减c D N A 文库，采用反向杂交验证，挑选出先兆子痫中的高表达基因，并测序分析；5 、对测序发现的先兆子高表达基因在大样本胎盘m R N A 进行斑点杂交观察其表达情况，统计学分析其意义。结果：1 、总R N A 及m R N A 的定
7、性定量分析紫外分光光度计检测显示正常妊娠胎盘总R N A 和m R N A 分别为0 2 m g m l 和4ug m l ：先兆子痫胎盘总R N A 和m R N A 分别为0 1 m g m l和2 5ug m 1 测定A 2 6 0 A 2 8 0 m n 、A 2 6 0 A 2 3 0 u r n 吸光度值分别为1 8 和2 0 。将总R N A 电泳见2 8 s 条带宽度和亮度1 8 s 条带宽度和亮度1 5 ，m R N A 电泳呈涂抹状( s m e a r ) ，片断7 0 5 k b 。2 、e D N A 合成产物及内切酶酶切和检测将d sc D N A 与R s a l
8、 d i g e s t e dc D N A 做电泳分析，两样品均里s m e a r 状，且酶切样品片断明显减小。3 、接头衔接效果分析接头衔接后P C R 扩增3 5 个循环做电泳分析见连接效率良好。4 、P C R 分析消减效率对消减后的产物分别以1 8 、2 3 、2 8 、3 3 个循环扩增，进行电泳分析扩增效率，显示消减效率良好。5 、P C R 产物的克隆和蓝白斑筛选对P C R 产物与T 载体连接，并采用热休克法将其导入致敏的3 m 1 0 9大肠杆菌中，蓝白斑筛选出6 0 个阳性克隆菌( 构建出e D N A 文库) 。6 、筛选出的阳性克隆菌反向杂交验证挑取6 0 个阳性
9、菌落点膜，以P Ee D N A 为探针反向杂交，低温放射自显影，发现有3 4 个菌落呈阳性，2 6 个菌落杂交呈阴性，予以排除。7 、序列分析测序及分析发现，在先兆子痫中，初步筛选出人类核蛋白多糖( D C N ) 转录变体Cm R N A 、人类胰岛素样生长因子结合蛋白1 ( I G F B P l )m R N A 、人类T 7 线粒体基因和人类M 2 线粒体基因为高表达的基因。8 、高表达基因在胎盘总体中的验证选择在P E 中高表达基因人类核蛋白多糖( D C N ) 转录变体Cm R N A和人类胰岛素样生长因子结合蛋白1 ( I G F B P 1 ) c D N A 为探针，与先
10、兆子痫和正常胎盘群体m R N A 斑点杂交，并对杂交结果分析发现该两个基因均在先兆子痫中的表达有显著性差异( P 2 1 1 5 K p a ，2 4 小时尿蛋白5 2 和( 或)水肿，并伴有头痛、眼花、恶心、呕吐、胸闷等自觉症状。 表l 胎盘来源详细资料( 二) 实验材料I 、生化试剂( 1 ) 一般生化试剂：柠檬酸钠，十二烷基肌氨酸钠( S a r c o s y l ) ，2 - 巯基乙 醇，乙酸钠( N a A C ) ，蔗糖，溴酚蓝，二甲苯青，氯仿( c h l o r o f o r m ) ，异戊醇，异丙醇，乙醇，琼脂糖，甲酰胺，酚，胰蛋白胨( B a c t o t r o
11、p t o n e ) ， 酵母粉( b a e t o y e a s te x t r a c t ) ，聚乙二醇( P E G ) ，矿物油，氯化钠，氯化钾，葡萄糖，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾；氯化氨，氯化镁，氯化钙，盐酸，氢氧化钠，氯化镁等均为国产分析纯。1 2( 2 ) 特殊试剂P o l y A T t r a c tm R N AI s o l a t i o nS y s t e m s 试剂盒美国P r o m e g aC L O N T E C HP C T - S e l e c tc D N AS u b t r a c t i o n美国C L O N T E C HK
12、 i t 试剂盒P G E M Ta n dP G E M TE a s yV e c t o rS y s t e m s 试剂盒美国P r o m e g aP C R S e l e c tD i f f e r e n t i a lS c r e e n i n gK i t 试剂盒美国C L O N T E C HN u c l e o S p i nN u c l e i cA c i dP u r i f i c a t i o nk i t s 试剂盒美国C L O N T E C H大肠杆菌( J M l 0 9 )北京鼎国二甲亚砜( D S M O )S i g m a
13、公司乙二氨四乙酸( E D T A )S i g m a 公司 焦碳酸二乙酯( D E P C )S i g m a 公司 溴化乙锭( E B )S i g m a 公司维生素B 1S i g m a 公司5 一溴一4 氯一3 一吲哚一1 3 - - D - - 半乳糖苷美国p r o m e g a 公司 异丙基硫代一1 3 - - D - - 半乳糖苷( I P T G )美国p r o m e g a 公N氨苄青霉素B M 分装B 一巯基乙醇S i g m a 公司3 一( N 一吗啉代) 丙磺酸( M O P S )美国p r o m e g a 公N 氯化钙( C a C l 2 )
14、美国p r o m e g a 公司尼龙膜( N y l o nm e m b r a n e s ，p o s i t i v e l yc h a r g e d )美国异硫氰酸胍上海生工生物工程有限公司( a - - 3 2 P ) d A T P北京亚辉生物医学工程公司2 、主要仪器：电子天平( F A l 0 0 4 )上海精科电泳仪( 恒压恒流D F D )北京东方特力材贸中兴高速冷冻离心机( T G L 1 6 G )上海安亭仪器厂高速台式离心机( T G L 1 6 B )上海安亭仪器厂高压消毒锅上海申安医疗器械厂紫外分光仪( W D 9 4 0 3 D )北京市六一仪器厂微波
15、炉格兰仕微量D N A R N A 定量仪A m e r s h a nP h a r m a c i aB i o t e c h 公司1 3紫外线防护眼罩北京科普气浴恒温振荡器( T H 2 8 2 B )江苏省金坛市医疗仪器厂三用恒温水浴箱( H H w )江苏省金坛市医疗仪器厂多功能分子杂交仪( F Y Y - 1 )江苏兴化市分析仪器厂冰箱( B C D 2 0 8 8 )海尔集团P C R 仪( B i o m e t r a )德国超净工作台上海锦屏仪器仪表有限公司电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂快速混匀器( S K - 1 )江苏省金坛市富华仪器有限公司3 、主要试剂配制3 1
16、0 7 5 M 柠檬酸钠( p H7 0 )柠檬酸钠2 2 0 6 9 双蒸H 2 01 0 0 m l溶解后1 5t o i n 2 消毒2 0 分钟后，贮存于室温密封保存。3 21 0 S a r c o s y lS a r c o s y l3 9H 2 03 0 m l3 3S 0 1 D异硫氰酸胍1 0 9H 2 01 1 7 m l0 7 5 M 柠檬酸钠( p n7 0 10 7 m l1 0 S a r c o s y l1 0 6 m l 2 一巯基乙醇0 1 m l3 40 5 D E P C1 0 0 m lD E P C0 5 m lH 2 09 9 5 m l3 55 甲醛变性胶缓冲液1 0 0 0 m l0 1 MMOPS(pH7 0 、4 0 r a m o l LN a A C5 m m o l LE D T A ( P H8 0 1将2 0 6 9M O P S 溶于8 0 0 m l 用D E
