《丙泊酚后处理对氧糖剥夺海马神经元ADAR2-AMPAR受体GluR2通路的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《丙泊酚后处理对氧糖剥夺海马神经元ADAR2-AMPAR受体GluR2通路的影响（67页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 分分 类类 号：号：R-614 学校代码：学校代码：1 0 0 6 2 密密 级：级： 学学 号：号：2012602840 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 MASTERS DISSERTATION 论文题目：论文题目： 丙泊酚后处理对氧糖剥夺海马神经元丙泊酚后处理对氧糖剥夺海马神经元 ADAR2-AMPAR 受体受体 GluR2 通路的影响通路的影响 T I T L E The effect of propofol post-conditioning on ADAR2-AMPA receptor GluR2 pathway in oxygen-glucose deprivation in
2、duced primary hippocampus neuron injury 一级学科：一级学科：临床医学临床医学 二级学科：二级学科：麻醉学麻醉学 论文作者：论文作者：朱朱 敏敏 指导教师：指导教师：王王海云海云 主任医师主任医师 天天 津津 医医 科科 大大 学学 研研 究究 生生 院院 二一二一五五年年五五月月分分 类类 号：号：R-614 学校代码：学校代码：1 0 0 6 2 密密 级：级： 学学 号：号： 2012602840 学位类别学位类别： 科学学位 专业学位 学科门类：学科门类：医学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 MASTERS DISSERTATION 论文题目：
3、论文题目：丙泊酚后处理对氧糖剥夺海马神经元丙泊酚后处理对氧糖剥夺海马神经元 ADAR2-AMPAR受体受体GluR2通路的影响通路的影响 T I T L E The effect of propofol post-conditioning on ADAR2-AMPA receptor GluR2 pathway in oxygen-glucose deprivation induced primary hippocampus neuron injury 一级学科：一级学科：临床医学临床医学 二级学科：二级学科：麻醉学麻醉学 论论文作者：文作者：朱朱 敏敏 指导教师：指导教师：王海云王海云 主任
4、医师主任医师 天天 津津 医医 科科 大大 学学 研研 究究 生生 院院 二一二一五五年年五五月月 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复
5、制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 保密 ，在 年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密 。 （请在相对应的方框内打“” ） 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名 ： 日期： 年 月 日 天津医科大学硕士学位论文 I 丙泊酚后处理对氧糖剥夺海马神经元丙泊酚后处理对氧糖剥夺海马神经元 ADAR2-AMPA 受体受体 GluR2 通路的影响通路的影响 中文摘要 我国现有脑卒中患者 700 万，年新增发病 160 万，约 60%患者不同程度丧失劳动力，因其高致残性和致死性，给患者及社会带来沉重负担；与此同时，临床工作中围术期手
6、术操作如颅内动脉瘤夹闭术等不可避免造成缺血再灌注损伤。作为临床麻醉医师，如何选择合理有效的麻醉药物及麻醉方法确保临床脑缺血高危患者围术期生命安全及预后，是值得慎重考虑的问题。通过长期前期研究，我们实验课题组发现，丙泊酚后处理神经保护作用通过多种机制通路发挥作用，其中兴奋性谷氨酸受体 -氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid，AMPA）受体 GluR2 亚基在神经突触后膜发生膜转位是其重要相关机制之一，然而如何调控 AMPA 受体GluR2 亚基的上游机制却并非完全清楚。 因此， 本研究旨在通
7、过建立离体海马神经元氧糖剥夺模型， 探讨作用于 RNA 的腺苷脱氨酶 2 （adenosine deaminase acting on RNA2，ADAR2）-AMPA 受体 GluR2 信号通路在丙泊酚后处理脑保护作用中的调控机制。实验主要分为两部分：第一部分，培养大鼠原代海马神经元并构建离体海马神经元氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation,OGD）模型。第二部分，探讨 ADAR2-AMPA 受体 GluR2 信号通路在丙泊酚后处理神经保护作用中的作用。课题组通过采用随机数字表格法将原代培养海马神经元依次分为四组（n=6） ：正常随机对照组（Con 组） ，氧糖剥夺组
8、（OGD 组） ，氧糖剥夺+丙泊酚后处理组 （Pro 组） ， ADAR2 siRNA 干扰组+氧糖剥夺+丙泊酚后处理组 （siADAR2组） 。24 小时后采用普通光镜照相观察神经元细胞形态，分别运用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）法和 3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT）法检测原代培养海马神经元细胞凋亡率和细胞存活率，蛋白免疫技术（Western Blot，WB） 方法检测 AMPA 受体 GluR2 亚
9、单位和 ADAR2 核蛋白编辑酶蛋白表达， 巢式逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction, RT-PCR）和特异性限制性内切酶 BbV1方法检测 AMPA受体 GluR2 亚单位 mRNA Q/R 位点编辑比例，采用细胞流式检测技术检测原代培养海马神经元细胞内钙离子浓天津医科大学硕士学位论文 II 度变化。实验结果表明：第一部分，原代培养神经细胞免疫荧光染色结果显示，原代培养细胞中绝大部分细胞为微管结合蛋白（microtubule associated protein, MAP2）标记阳性的神经元细胞，神经元细胞培养纯度达
10、到 95%以上（P0.05） 。因此我们于慢病毒感染原代海马神经元 3 天后提起细胞总蛋白，通过蛋白电泳检测方法测定慢病毒沉默效果。 应用 Western Blot 实验方法， 我们试验中检测了慢病毒对于原代海马神经元ADAR2 蛋白表达水平的沉默效率， 实验结果表明， 与随机对照组神经元 ADAR2蛋白表达水平相比， 实验组神经元 ADAR2 蛋白表达明显降低， 具有统计学差异。 天津医科大学硕士学位论文 结果 25 图 2.3 慢病毒转染原代神经元细胞转染效率鉴定以及蛋白表达 注：与 si-control 组相比，*P0.05 2.4 光镜下不同分组神经元实验处理后 24 小时神经元细胞细
11、胞形态的变化 本课题实验结果显示，正常随机对照组原代神经元细胞无需经过任何实验处理，保持其自然生长条件，因此其神经元细胞生长状态良好，细胞贴壁分布较为均匀，审计光源细胞胞质透亮，神经突起粗壮，神经末端分支明显且密集链接成网状，生长较为成熟；氧糖剥夺 OGD 损伤处理后神经元细胞胞体开始发生皱缩，而且些许突起断裂且突起彼此之间网络稀疏，原先透亮的细胞折光性发生降低；丙泊酚后处理后细胞形态变化明显，胞体趋于圆润，突起清晰粗壮，与正常随机对照组类似； 转染组原代神经元细胞形态改变类似OGD处理损伤组，细胞活力下降明显，如图所示： 图 2.4 光镜下不同分组神经元细胞形态变化 2.5 MTT 法检测不
12、同分组神经元实验处理后 24 小时神经元细胞细胞存活率 我们的实验结果显示发现，与随机对照组相比，OGD 组、Pro 组以及si-ADAR2 基因沉默组原代海马神经元细胞细胞存活率显著降低（P0.05） ；与OGD 组相比，丙泊酚后处理组 Pro 与慢病毒沉默组 si-ADAR2 神经元细胞存活率增加，且具有统计学差异（P0.05） ；慢病毒沉默组通过沉默 ADAR2 表达，可以有效逆转丙泊酚后处理保护作用，具有统计学差异（P0.05） 。 天津医科大学硕士学位论文 结果 26 图 2.5 不同分组神经元细胞实验处理后细胞存活率比较 注：与 control 组相比，*P0.01; 与 OGD
13、组相比, #P0.05; 与 Pro 组相比，*P0.05. 2.6 LDH 法检测不同分组神经元实验处理后 24 小时神经元细胞细胞凋亡率 本课题实验结果显示， 与随机对照组相比， OGD 组、 Pro 组以及 si-ADAR2基因沉默组神经元细胞凋亡率显著增加（P0.05） ；与 OGD 组相比，丙泊酚后处理组 Pro 与慢病毒沉默组 si-ADAR2 神经元细胞凋亡率显著降低（P0.05） ；慢病毒沉默组通过沉默 ADAR2 基因表达，可以有效逆转丙泊酚后处理保护作用，具有统计学差异（P0.05） 。 图 2.6 不同分组神经元细胞实验处理后细胞 LDH 释放比例比较 天津医科大学硕士学
14、位论文 结果 27 注：与 control 组相比，*P0.01; 与 OGD 组相比, #P0.05; 与 Pro 组相比，*P0.05. 2.7 巢式 RT-PCR 法检测不同分组神经元实验处理后 24 小时神经元细胞 AMPA 受体 GluR2 亚基 pre-mRNA Q/R 位点编辑比例 研究发现正常神经元细胞中GluR2亚单位pre-mRNA在ADAR2作用下Q/R位点一个腺嘌呤核苷水解成次黄嘌呤核苷，使得中性谷氨酰胺残基被正电荷精氨酸残基取代，保持 AMPA 受体低钙通透性。巢式 PCR 通过两次 PCR 技术，依靠初级 PCR 产物作为模板，构建新的引物，重新建立反应体系，不仅能
15、够增效 PCR，而且提高了最终产物的特异性。本课题实验结果发现，与随机对照组相比， OGD 组、 Pro 组以及 si-ADAR2 基因沉默组神经元细胞 AMPA 受体 GluR2亚单位 pre-mRNA Q/R 位点编辑比例降低（P0.05） ；与 OGD 组相比，丙泊酚后处理组 Pro 与慢病毒沉默组 si-ADAR2 神经元细胞 pre-mRNA Q/R 位点编辑比例增加（P0.05） ；慢病毒沉默组通过沉默 ADAR2 基因表达，可以有效逆转丙泊酚后处理保护作用，具有统计学差异（P0.05） 。 图 2.7 不同分组神经元细胞实验处理后细胞 LDH 释放比例比较 注：与 control 组相比，*P0.01; 与 OGD 组相比
