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1、福建医科大学硕士学位论文PTEN蛋白在大鼠腹主动脉球囊损伤后的表达研究姓名：柯文志申请学位级别：硕士专业：内科学（心血管病）指导教师：浦晓东20081101P T E N 蛋白在大鼠腹主动脉球囊损伤后表达的研究摘要目的研究P T E N 蛋白( p h o s p h o t a s ea n dt e n s i nh o m o l o gd e l e t e do nc h r o m o s o m et e n ) 在大鼠腹主动脉球囊损伤后动态表达及其在内膜增生中的作用；探讨其对内膜增生作用的可能机制。方法雄性S D 大鼠5 6 只，随机分为假手术组( 8 只) 、单纯球囊损伤组(
2、 4 8只，包括1 天、4 天、7 天、1 4 天、2 1 天、2 8 天组) ，建立大鼠腹主动脉球囊损伤模型。各组分别于术后2 8 、l 、4 、7 、1 4 、2 1 、2 8 天手术切取损伤腹主动脉作为实验组标本。进行一F Y U 检测：( 1 ) 行H E 及V e r h o e f f 弹力纤维染色，光镜下观察血管内膜增生情况，并在计算机图像分析仪下测量、分析血管内膜厚度；( 2 ) 应用P T E N多克隆抗体S A B C 法免疫组化染色，4 0 0 x 光镜下观察，并计算阳性细胞百分比，观察术后不同时间P T E N 蛋白表达情况。同法应用P C N A 单克隆抗体S P 法
3、免疫组化染色，计算阳性细胞百分比，表示V S M C 增殖程度。观察P T E N 与P C N A 表达变化的关系。( 3 ) W e s t e r nb l o t t i n g 检测：分析P T E N 蛋白的表达情况，观察其动态变化。所得数据应用S P S S l 2 0 1 统计软件分析，计量资料结果以X s 表示，采用单因素方差分析( o n e w a yA N O V A ) ，P 0 0 5 )2 、假手术组和1 4 天组大鼠血脂水平的变化( 见表2 )1 6注：假手术组跟1 4 天组Z 阿大鼠血脂水平差异无显著性， 00 53 、血管病理形态学检测：假手术组内弹力板完整
4、，血管内膜光滑，可见内皮细胞分布均匀血管壁层次清晰( 见图1 ) ：球囊损伤后l 天，血管内弹力板断裂，内皮细胞剥脱，表面毛糙；球囊损伤后4 天，中层V S M C s 开始向内膜迁移，内弹力膜断裂，可见少量内膜表面增生( 见图2 ) ：球囊损伤7 后天，内膜层细胞核深染提示增生活跃，内膜增生、增厚，( 见剖3 ) ；球囊损伤后1 4 2 8 天，血管壁明显增厚，以内膜增厚为主，管腔缩小，内膜中有大量细胞外基质和V S M C s ( 见图4 、5 、6 ) 。譬。痧j ：磐：o7 ，善：i t 搽、；，一一? l夸j 嘤 瘟墨圈一阚一田5球囊损伤2 l 天组可见血管内膜 显著增厚有大量平滑肌
5、细胞，管腔狭窄 ( H E 染色)4 、血管内膜增生情况( 见表3 )圈6球囊损伤2 8 天组可见内膜增生明显并 可见大量排列紊乱的平滑肌细胞和细胞外基质昔 腔明显狭窄( t i e 染色)袁3 大鼠球囊擅仿后备组血管内腆与中腆( I 膻) 厚度比值变化f 尊况( 孑士s )往：与对照组M ，妒 0 0 5 ) ，l 天“ - 2 1 天各组与正常比较差异显著( P O 0 5 ) ，各组与正常及7 天比较都有显著差异( P 0 0 5 )。 观察球囊损伤动脉中P T E N 与P C N A 的表达变化，1 4 天内P C N A 高表达伴随血管 平滑肌大量增殖，血管内膜迅速增生，此时P T
6、 E N 呈低表达；P C N A 表达下降伴随血 管平滑肌增殖及内膜增生速度减慢，而此时P T E N 表达上升，并大量表达。P ，l 、E N 表 达在P C N A 表达1 周后达到高峰。4 周时，P T E N 、P C N A 表达都趋于稳定，动脉内膜增 生也趋于稳定( 图9 ) 。表4 免疫组化检测P T E N 及P C N A 表达阳性率( ) ( i 土S )注：L j 正常比较P O 0 5 ，与7 天比较“P 0 0 5 ，! j1 4 天比较4 P 0 0 51 9田9P l a N 与P c N 在不同时期球囊损伤动脉中表达的变化田1 0 假手术组P 俐蛋白免痤组化染
7、色正常动脉阳性表达圈1 l 球囊损伤4 天组P T 斟蛋白迅速下降呈低水平表达。圈1 2 球囊损伤7 天组可见内膜棕褐色沉淀圈1 3 球囊损伤1 4 天组可见内膜棕褐 一进一步增多，内腆进一步增生。一色沉淀明显增加，内膜增厚较明显。圈1 4 球囊损伤2 1 天组P T E N 蛋白表达仍维持在较高水平。圈1 5 球囊损伤2 8 天组”刚阳性细胞数有所下降。圈1 6P C N A 免疫组化染色球囊损伤术后7天表达至高峰。圈1 7P C N A 免疫组化染色球囊损伤术后2 8 天表达显著下降。7 、P T E N 蛋白w e s t e r nb l o t t i n g 检测结果 W e s
8、t e r nb l o t t i n g 与免疫组化检测结果趋势基本一致，表示P T E N 蛋白表达变 化。术后1 天及4 天几乎检测不出，术后7 天又出现表达，至1 4 天表达明显，2 1 天仍维持在较高水平，2 8 天与正常水平相当，第七条带为正常动脉，条带清晰呈较 高表达( 图1 8 ) 。从左到右分别为：l ：1 天组2 ：4 天组3 ：7 翘4 ：1 4 天组52 1 天组62 8 天组7 ：似手术组图1 8w e s t e r nb l o t t i n g 检测P T E N 在球囊损伤动脉中不同时间点的表达情况讨论P C I 已成为治疗冠心病的一种重要手段，但术后再狭
9、窄却成为影响其疗效的关键因素。多年来，国内外学者建立了多种动物模型来模拟P C I 术后再狭窄过程，以便从基础实验中研究再狭窄机制及其防治措施。虽然还没有一个动物模型能模拟P C I 术后再狭窄发生全过程中的所有因素，但动物模型可用来研究引起再狭窄的某些环节，对研究再狭窄形成机理及防治措施有重要指导价值。目前再狭窄常用的动物模型制作方法是通过模拟P T C A 过程，造成大、中动脉扩张性损伤，进一步出现内膜增生、血管狭窄的病理变化。当前常用的动物有大鼠、猪、狗及兔等动物。本实验选用大鼠为实验对象，动物为封闭群大鼠，个体差异小，实验结果重复性好，且易于饲养，是目前研究再狭窄较为常用的动物；实验选
10、取大鼠腹主动脉做为实验观察的靶血管，其管腔大小适中，中膜肌层较厚，可较好的模拟人的冠状动脉。本实验通过组织形态学观察证实，经过球囊内皮剥脱术后，剥脱段内皮几乎完全消失，内膜增生明显，说明动脉损伤一再狭窄的模型复制成功。各组大鼠术前体重差异无显著性意义，可以控制大鼠在体重差异上对血管组织、细胞数量上的影响，减少实验结果的可靠性影响；假手术组和1 4 组大鼠血脂水平差异无显著性意义，提示手术因素对血脂的影响可忽略，可减少血脂变化对动脉血管粥样硬化等血管壁、血管内膜细胞、平滑肌细胞改变的影响。本实验发现单纯球囊损伤后4 天出现内膜少量增生，中层V S M C s 开始向内膜下迁移；7 天见内膜增生较
11、明显，V S M C s 中等量增生，细胞排列紊乱，细胞外基质增多；1 4 “ - - 2 8 天血管内膜进一步明显增厚，内有大量不规则排列的V S M C s 和细胞外基质，光镜下可见内膜细胞核数量明显增多、核深染，提示内膜细胞增生活跃。计算机图象分析结果表明球囊损伤后血管内膜与中膜厚度比值随着时间的推移进行性升高。血管球囊损伤后在损伤、血液动力学变化等诸多因素的刺激下，脱离正常生长调控机制，血管壁细胞增殖与凋亡调控失衡，许多细胞因子参与这个复杂的过程。P T E N 是细胞内的主要负性生长调控因子。P T E N 基因是1 9 9 7 年，L i 等n 7 1 分离得到一种新的基因，由于这
12、些结构特点，该基因被命名为与细胞骨架蛋白t e n s i n 同源在1 0 号染色体有缺失的磷酸酶( p h o s p h a t a s ea n dt e n s i nh o m o l o g yd e l e t e do nc h r o m o s o m et e n ，P T E N ) 。另有两个研究小组也在1 0 q 2 3 分离到新的基因，分别被2 2命名为在多个进展期肿瘤中有突变的基因( m u t a t e di nm u l t i p l ea d v a n c e dc a n c e rl ，M M A C l ) n 引、被转化生长因子1 31 调
13、控在上皮细胞中高度表达的磷酸酶( T G F 一1 3l r e g u l a t e d a n de p i t h e l i ac e l l e n r i c h e dp h o s p h a t a s el ，T E P l ) 。后经比较c D N A证实P T E N 、M M A C l 、T E P l 三者为同一种摹因。P T E N 基因位于人类染色体1 0 q 2 3 3位点，包含9 个外显子和8 个内含子，5 端有8 0 4 个核苷酸的非翻译区，其后有长度为1 2 0 9 b p 的开放阅读框架。编码的P T E N 蛋白由4 0 3 个氨基酸残基组成，分
14、子量约4 7 k d ，应用免疫荧光显微镜发现蛋白定位于胞浆中。P T E N 蛋白主要结构功能区位于N 端，其N 端与细胞骨架蛋白( t e n s i n ) 和辅助蛋白( a u x i l i n ) 高度同源引，第1 2 3 1 3 2 位氨基酸残基为蛋白质酪氨酸磷酸酶( p r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a s e s ，P T P ) 催化区，其中包含一个酪氨酸和双重特异性磷酸酶关键序列。C 端由5 0 个氨基酸组成，所含P D Z 结构域在调节P T E N 稳定性和酶活性方面起重要作用。血管平滑肌的增殖、迁移是内膜增生的主
15、要凶素，P T E N 抑制血管内膜增，羔及再狭窄过程中的平滑肌细胞增殖、迁移，主要是通过P L 3K A k t 信号途径。P T E N 作为磷酸酶，特异性地使磷脂酞肌醇一3 ，4 ，5 一三磷酸( P I P 3 ) 及磷脂酞肌醇一3 ，4 一二磷酸( P I P 2 ) 的肌醇环D 3 位去磷酸化，分别生成P I P 2 和P I P 。这些D 3 磷脂是磷脂酞肌醇3 一激酶( p h o s p h a t i d y l i n o s i t i d e3 - k i n a s e ，P 1 3K ) 的直接产物。在一些生长因子如血小板源性生长因子( P D G F ) 、胰岛
16、素样生长因子( I G F ) 、表皮生长因子( E G F )的刺激下激活P 1 3 K ，P 1 3 K 的活化底物P I P 3 使S e r T h r 激酶A k t ( 亦称P K B 或R A C l )磷酸化而激活。A k t 的活化导致一些抗凋亡的靶基因磷酸化而失活或表达下调，包括B c l - 2 家族成员B a d ，叉头转录囚子F K H R ，细胞凋亡蛋白酶c a s p a s e 一9 的分裂等呦1 ，而m T O R 和它的下游分子户O S 6 K 和4 E - B P I 活性增强伫。由于拈抗了P 1 3K A k t信号系统，P T E N 使A k t 活性降低，提高了促凋亡因子B a d ，F K H R ，c a s p a s e - 9 水平，增加划凋亡的敏感性。P T E N 过表达刺激细胞合成3 种c y c l i n 依赖性激酶的抑制因子p 2 1 W A F I 、p 2 7K I P l 和p 5 7 K I P
