《YAP和P14ARF基因表达及P14ARF基因启动子甲基化与甲状腺乳头状癌的相关性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《YAP和P14ARF基因表达及P14ARF基因启动子甲基化与甲状腺乳头状癌的相关性研究（53页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、温州医学院硕士学位论文Y A P 和P 1 4 孵基因表达及P 1 4 根9 基因启动子甲基化与甲状腺乳头状癌的相关性研究答辩委员会主席：邳歪刖塾援答辩委员会成员：篮筮狴塾援虞叠搓麴握论文答辩日期：2 0 1 3 年0 5 月2 6 日温州医学院硕士学位论文目录I Y l l 2 lU 3 lU19ll117lll1 4llll7lll l l o l l Y 2 3 9 7 4 7 0 1 中文摘要42 英文摘要64 材料与方法。115 结果2 26 分析与讨论2 88 参考文献3 39 附录。3 510 致谢，3 61 l 综述3 712 参考文献4 913 文独创性声明、论文使用授权声明
2、5 4温州医学院硕士学位论文Y A P 和P 14 胩基因表达及P 1 4 腑基因启动子甲基化与甲状腺乳头状癌的相关性研究中文摘要目的：探讨Y A P ( Y e s a s s o c i a t e dp r o t e i n ) 基因与状腺乳头状癌( p a p i l l a r yt h y r o i dc a r c i n o m a ，P T C ) 发生发展的关系及其生物学意义，探讨甲状腺乳头状癌中用彬基因启动子甲基化及蛋白的表达及意义，分析Y A P 基因和P 1 4 基因在甲状腺乳头状癌中表达的相关性。材料与方法：1 材料：选自台州学院附属台州市立医院肿瘤外科2 0
3、1 1 年2 月至2 0 1 1 年9 月期间的手术切除组织标本共4 0 例。其中实验组甲状腺乳头状癌2 0 例，男性6 例，女性1 4 例，年龄2 3 6 5 岁，平均4 5 3 岁，根据患者年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移情况分成哑组，其中肿瘤组中年龄4 5 岁1 5 例， 2 c m 的l l 例，肿瘤直径2 c m 的9 例：伴淋巴结转移4 例，无淋巴结转移1 6 例：对照组为随机选取的结节性甲状腺肿手术标本中相对正常的组织，男性9 例，女性l l 例，年龄2 6 - 5 7 岁，平均4 0 2 岁。标本体积约5 x 5 m m 大小，其中1 2 于2 0m i n 内置于一8 0 。
4、C 冰箱中保存，用于甲基化特异性P C R 、实时定量P C R 及W e s t e r nb 1o t 检测：另1 2 置于1 0 福尔马林溶液中固定，用于免疫组织化学检测。所有标本均经病理证实，且经病患同意；所有病例术前均未行放疗或者化疗。2 方法2 1Q R T P C R ( 实时定量P C R ) ：检测H P 基因m R N A 在甲状腺乳头状痛及对照组间的表达情况；检测P I m R N A 在甲状腺癌组织、对照组中的表达情况，组间采用t 检验，P O 0 5 )3 I I t O ；Y A P 蛋白在对照组中表达均呈强阳性，甲状腺乳头状癌组织中呈弱阳性，P 1 4 “”蛋白在
5、对照组中表达均呈强阳性，甲状腺乳头状癌组织中呈弱阳性。并且具有统计学意义( P 1 用B C A 法测蛋白浓度，根据蛋白质曲线计算电泳所需蛋白，配置1 0 浓缩胶和5 的分离胶，上样量每孔为5 0 u g ，标准蛋白M a r k e r为5 “l ，8 0 、1 2 0 v 电泳，恒压l O vl h 转膜至硝基纤维膜上，5 脱脂奶粉封闭2 h ，加入一抗3 m l ( Y A P 抗体浓度1 ：1 0 0 0 ) 4 冰箱过夜，加入二抗体( H R P 标记的山羊抗兔I g G 抗体，浓度为l ：5 0 0 0 ) 室温静置1 5 h ，E C L 发光液滴加，暗室曝光显影定影，计算机软件
6、分析蛋白灰度。五、实验步骤1 R e a l t i m eP C R 的流程1 1 R N A 抽提：1 1 1 取组织块5 0 一1 0 0m g 用液氮在研钵中研磨成粉木1 1 2 移入玻璃匀浆器加入l m lT r i z o l 抽打匀浆l 。1 3 移入1 5 m t 新离心管用5 m l 针头抽打1 1 4 冰上孵育5 分钟1 I ，5 离心1 2 ，0 0 0 94 5 分钟取上清液移入1 5 m l 新离心管1 1 6 加0 2m l 氯仿，震荡，冰上孵育5 分钟1 1 7 离心1 2 ，0 0 0 94 1 0 分钟，取上层液相移入1 5 m l 新离心管1 1 8 加0
7、5m l 异丙醇，震荡，冰上孵育5 分钟1 1 9 离，01 2 ，0 0 0 94 5 分钟，弃去上清液1 1 1 0 加入1m l7 5 乙醇，震荡1 1 Il 离心7 ，5 0 0 94 5 分钟，弃去上清液1 1 1 2 室温下使之变透明1 1 1 3 加入D E P C 处理水3 0ul 溶解R N A ( 可保存在液氮或低温冰箱)1 1 1 4R N A 变性电泳观察1 8 s 、2 8 s 条带，分光光度计检测2 6 0 2 8 0 吸光度比值，计算R N A 浓度温州医学院硕士学位论文1 2c D N A 合成( 2 0ul 反应体系) ：取2ulR N A2ul1 0 R T
8、m i x ( 终浓度为l )2uld N T P 混合液( 终浓度为0 2 5m m o l Le a c hd N T P )2ulO l i g o d T l 5 ( 终浓度为lum o L )1ulQ u a n tR e v e r s eT r a n s c r i p t a s eR N a s ef r e ed d H 2 0 至终体积为2 0ul3 7 孵育6 0m i n 。I 3 反应步骤；1 3 19 5 预变性2 m i n ，为第一步1 个循环1 3 29 5 变性1 5 s ，6 5 退火3 0 s ，6 8 延伸6 0 s ，为第二步共4 0 个循环。最
9、后9 5 1 5S ，降温至6 0 1m i n ，然后按每i 5 s 上升0 3 至9 5 后，保持1 5 s 。分别收集荧光信号，进行熔解曲线分析。2 免疫组织化学操作步骤2 1 新取组织制作蜡块者需经1 0 甲醛溶液固定1 6 小时以上，石蜡包埋、切片4um 厚。6 8 烤片+ 3 0 m i n 。2 2 石蜡切片脱蜡至水：经二甲苯1 、二甲苯2 、1 0 0 乙醇、1 0 0 乙醇、9 0 乙醇、9 0 乙醇、8 5 乙醇、8 0 乙醇、7 5 乙醇、7 5 乙醇分别浸泡1 5 m i n 、1 5 m i n 、1 0 m i n 、1 0 m i n 、5 m i n 、5 m
10、i n 、3 m i r l 、3 m i n 、1 m in 、i m i n 。2 3 滴加3 过氧化氢于组织上避光湿盒孵育l O m i n 。2 4 P B S 缓冲液洗5 m i n 3 次，甩掉并擦干组织周围的液体( 组织切勿干燥) 。2 5 将玻片插入染色架上，于0 I m m o L 枸橼酸缓冲液煮沸修复抗原15 m in 。2 6 室温自然冷却2 0 m i n 以上，缓慢降至室温。P B S 缓冲液洗5 m i n 3 次，甩掉并擦干组织周围的液体( 组织切勿干燥) ，平放于湿盒中。2 7 玻片滴加3 B S A 或1 0 山羊血清封闭3 0 m i n ，倾去。2 8 玻
11、片滴加一抗，4 过夜。2 93 7 复温4 5 m i n ，P B S 缓冲液沈5 m i n x3 次，甩掉并擦干组织周围的液体( 组织切勿干燥) ，平放于湿盒中。2 1 0 分别加入二抗，3 7 。C 3 0 m i n ，P B S 缓冲液洗5 m i n 3 次，甩掉并擦干组织周围的液体( 组织切勿干燥) ，平放于湿盒中。2 1 1 滴加预备好的D A B 工作液5 0 一1 0 0ul ，光镜下控制显色，显色完全后，用蒸馏水冲洗终止显色。2 1 2 苏木素复染5 m i n ，流水冲洗2 0 m in 。2 1 3 各级酒精脱水( 以上酒精浓度，方向相反，时间同上) 、二甲苯透明5
12、 m i n 31 4温州医学院硕士学位论文次。2 1 4 取出玻片，用中性树脂封片。2 1 5 显微镜下判读结果。3 w e s t e r n b l o t 操作步骤3 1 蛋白质样品获得：机械或超声波室温匀浆0 5 一l m i n 。然后4 。C ，1 3 ，0 0 0 9 离心1 5 m i n 。取上清液作为样品。3 2 电泳：制备电泳凝胶，进行S D S P A G E 。3 3 转移：( 半干式转移)3 3 1 电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5 m in X3 次。3 3 2 膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和N C 膜，浸入转膜缓冲液中1 0 m i
13、n 。3 3 3 转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、2 4 层滤纸、N c 膜、凝胶、2 4 层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、N C 膜精确对齐，每一步去除气泡，上压5 0 0 9 重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源，恒流l m A c m ，转移1 5 h 。转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中5 0 s 后，在5 0 甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。3 4 免疫反应：3 4 1 用0 0 1 M P B S 洗膜，5 m i n 3 次。3 4 2 加入包被液，平
14、稳摇动，室温2 h r 。3 4 3 弃包被液，用O 0 1 M P B S 洗膜，5 m i n 3 次。3 4 4 加入一抗( 按合适稀释比例用0 0 1 MP B S 稀释，液体必须覆盖膜的全部) ，4 。C 放置1 2 h r 以上。阴性对照，以I B S A 取代一抗，其余步骤与实验组相同。3 4 5 弃抗和I B S A ，用0 0 1 M P B S 分别洗膜，5 m i n 4 次。3 4 6 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗( 按合适稀释比例用O 0 1 MP B S 稀释) ，平稳摇动，室温2 h r 。3 4 7 弃二抗，用0 0 1 M P B S 洗膜，5 m i n 4
15、 次。3 4 8 加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。六、统计学处理应用S P S S l 2 0 0 统计软件包对数据进行处理，采用矿检验、T 检验对结果进行统计分析。第二部分：P 1 4 胩基因表达及其启动子甲基化与甲状腺乳头状癌的相 关性研究温州医学院硕士学位论文一、研究对象：1 标本来源：选自台州学院附属台州市立医院肿瘤外科2 0 1 1 年2 月至2 0 1 1 年9月期间的手术切除组织标本。对照组为随机选取的结节性甲状腺肿手术标本中相对正常的组织。标本体积约5 X 5 m m 大小，其中l 2 于2 0m i n 内置于一8 0 。C 冰箱中保存，另1 2 置于1 0 福尔马林溶液中固定。所有标本均经病理证实，且经病患同意；所有病例术前均未行放疗或者化疗。2 临床资料：其中实验组甲状腺乳头状癌2 0 f f 0 ，男性6 例，女性1 4 f f 0 ，年龄2 3 、6 5岁，平
