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1、试 验 研 究2 0 0 9 7 1 ! ! ! ! ! ! ! ： 竺 竺墨竺兰墨 应用 S S R技术进行黄瓜杂交种种子纯度鉴定 王全张桂华苗伟利 种子纯度鉴定是保证种子质量 的关键环节。随 着育种进程的加快 ，黄瓜新品种数量不断增加 ， 需 要进行品种纯度鉴定的材料将会越来越多。以往纯 度鉴定都是在田间进行 ， 存在周期长 、 工作量大 、 易 受环境因素的影响 、 表型特征会有一定程度偏差等 问题 ， 可能影响品种纯度鉴定的准确性 ， 并直接影 响 到 良种 的推 广 ； 此 外 由于 鉴定 周 期 长 ， 当 年生 产 的种子往往要到次年才能销售 ， 造成商机丧失。分 子标记技术 的
2、快速发展 为种子的纯度鉴定提供 了 一种更为快速、 高效 的方法 1 卅， 其 中 S S R标记技术 是最为简便 、 可靠的鉴定方法之一。 艾呈祥等【5 在西 瓜上 的研究表 明， 利用 S S R引物进行扩增 ， 杂交种 条带均为父母本的互补型 ， 且利用 S S R技术所测种 子纯度与田间纯度鉴定结果非常接近 ， 很适合做杂 交种纯度鉴定。殷兆晴等嘲 应用 S S R技术对 四川省 6家种子企 业 生产 的两 个 杂交 水稻 品种 及其 亲本 进 行 了田问和 S S R标记纯度鉴定 ， 结果表明两种鉴定 方法无显著差异 。均可用于种子纯度检测 ， 但分子 标记纯度检测的结果更准确 、
3、可靠 。 试验采用 目前生产上大面积栽培的黄瓜 品种 及其亲本为试材 ， 研究利用 S S R技术进行纯度鉴定 过程 中的各个关键环节 ， 并筛选其特异谱带 ， 并以 该谱带作为分子标记对其纯度进行鉴定 。 1 材料与方法 1 1 试 验材 料 试验材料为津优 1 号黄瓜及其 亲本 ， 天津科润 黄瓜研究所提供 。 基金项 目： 天津市应 用基础研究计划项 目( 0 7 J C Y B J C 1 2 2 O 0 ) 资助 王全， 天津科 润黄瓜研 究所 ， 3 0 0 1 9 2 张桂 华， 苗伟 利， 天津科润黄瓜研 究所 收 稿 日期 ： 2 0 0 9 0 2 2 5 1 2试 验方
4、法 黄瓜种子基因组 D N A提取a 干燥种子基 因组 D N A的提 取 。利 用 C r A B法 7 1 和 S D S法 8 提取 黄瓜 干燥种 子基 因组 D N A。 b 发芽种子基 因组 D N A 的提取 。采用催 芽 4 8 h 黄瓜种子的子叶和根尖部分提取基因组 D N A。 取单 粒黄瓜发芽种子的子叶或者根尖部分 ， 放到 1 5 mL 离心管中， 加入 2 0 0 L C T A B提取液 ， 用研棒充分 研碎 ， 倒置混匀后 ， 6 5 c I = 水浴 1 0 mi n ； 加人等体积氯 仿： 异戊醇 ( 2 4 ： 1 ) ， 充分倒置混匀 ， 于 1 2万 r
5、mi n离 心 1 0 m i n ； 取 上清液 ， 加入 2 3倍 体积异丙醇混匀 ( 轻轻倒转 ) ， 于常温下放置 5 mi n ， 8 0 0 0 r m i n离心 5 m i n ； 弃上清液 ， 倒置 吸干后 ， 加入适 量 l T E， 置 于一 2 0 冰箱 中保存 ， 以备后用。 津优 1号黄瓜特异谱带筛选 以津优 1号 及其亲本 的基因组 D N A为模板 ，采用 以下反应体 系 和 P C R程序 进 行扩增 。 S S R反 应 总 体 系 为 1 0 L，包 括 ： 1 x b u f f e r 、 d N T P( 2 mm o 1 ) 、 P r i me
6、r ( 1 5 0 n g ) 、 D N A( 3 0 n g ) 、 T a g 酶 ( 0 5 U) 。P C R反应程序 ： 9 4 ， 3 mi n ， 1 个循环 ； 9 4 3 0 S ， X o C 3 0 S ， 7 2 6 0 S( X 为不 同 S S R引物 的退火温度) ， 3 4个循环； 7 2 7 m i n ； 4 C 保存 。 扩 增 结束 后 ，采 用 5 变性 聚丙烯 酰胺 凝胶 电 泳进行分离。 杂交种带型为父母本互补型 的引物人选 。 特异谱带的验证用人选 的引物对 5 0粒津 优 1 号种子进行 S S R鉴定 ， 比较分子标记方法与田 间鉴定方法的
7、可靠性。 2 结果 与分析 2 1 高效 的种 子基 因组 D N A提取 方法 的建 立 干燥黄瓜种子基 因组 D N A的提取分别采 用 C T A B法 和 S D S法 提 取 干燥 黄 瓜 种 子 D N A。试 验结果表 明 ， 利用 C T AB法提取 的过程 中， 在用氯 43 J OURN AL OF CHAN Gd lANG VE GE TAB L E S 图 1 黄瓜发芽种子基因组 D N A的电泳检测 P l P 2 F l _ 图2津优1号黄瓜品种特异引物 Pl：母本；P2：父本；Fl：津优1号 仿一 异戊醇粗提完毕后的上清液 中加入异丙醇沉淀 D N A的时候 ，
8、液体变为极为浑浊 的乳白色液体 ， 说 明干燥种子中存在 的某种物质 ， C T A B无法粗提干 净 ， 因此 能够从 干燥 的黄瓜种 子 中提 取 出 D N A。而 利用S D S方法， 提取到 了 D N A， 琼脂糖检测发现 ， 所 提取的 D N A带型整齐 ， 没有降解。 但进一步用该方 法提取到的 D N A进行 S S R扩增的时候 ，却不能扩 增出条带， 可能里面含有某种抑制扩增的物质存在。 发芽种子基因组 D N A的提取黄瓜种子在 出售前 除 了要 进行 种子 的纯 度 检测 外 ， 还必 须进 行 种子发芽率 、 发芽势的检测。为了避免重复抽样 ， 造 成不必要的种子
9、浪费 ， 本研究创新性地利用发芽率 检测后的发芽 4 8 h种子的子叶和根尖部分 同时进 行了基因组 D N A的提取 ， 结果显示 ， 两者都能提取 到较高质量的 D N A， 但二者相 比， 利用根尖部位提 取 D N A方法简便 、 快速 ， 仅用 1 h就能够提取到高 质量 的 D N A( 图 1 ) ， 大大节 省 了时间 。 2 2 特异谱带的筛选 利用 S S R技术对我所黄瓜新品种津优 1号及 其亲本进行了特异分子标记分析 ，共利用 6 0多对 S S R引物进行 了 P C R扩增 ，其中有 l 对 S S R引物 在双亲及杂种后代中表现共显性分离 ， 即杂种后代 的带 型
10、为 父母 本 的互补 型 ( 图 2 ) ， 可 以用 来进 行 杂 交种子的纯度鉴定。 2 - 3 利用筛选到的特异分子标记进行大规模种子 纯度鉴 定 用 以上入选 的引物对 5 0粒津优 l号种子进行 了 S S R鉴定 ， 结果显示 ， 分子标记方法与 田问鉴定 方法可靠性都在 9 6 以上。2 0 0 7年我所开始大规 模利用分子标记方法对津优 1 号黄瓜杂 交种子进 行室 内纯度鉴定 ，先后共对 5万余 k g黄瓜新种子 进行了纯度检测 ， 大大节省了时间和成本。 一4 4 3 小结与讨论 本研 究 通过 对不 同提 取方 法 、 不 同提 取部 位及 提取步骤的优化 ，建立 了高效
11、的黄瓜种子基因组 D N A提取的方法。 采用改 良C T A B方法从发芽 4 8 h 的种子的根尖部位提取高质量的黄瓜基因组 D N A， 仅 需要 1 h的 时间 。 由于每 年 的种 子在 出售之 前 ， 除 了要进行纯度检测之外 ，还必须进行种子发芽 率 、 发芽势 的测定 ， 因此本研究创新性地应用发芽 率 、 发芽势测定之后的种子进行纯度检测 ， 这样既 避 免 了种 子浪 费 ，又 节省 了重 新 催芽 所 需 要 的 时 间 。 通过对 5 O粒津优 1号种子的田间鉴定和分子 鉴定进行 比较分析 ，认为在对种子进行纯度鉴定 时 ，分子鉴 定 与 田间鉴 定纯 度有 较好 的一
12、致 性 ， 鉴 定 的总结果从统计上没有明显差异 ， 可以用 S S R标 记 鉴 定来代 替 田间纯度 鉴定 ， 从 而 克服 田间鉴定 周 期长 、 易受环境条件影响等缺点。 另外 ， 采用 S S R技术进行纯度鉴定时 ， 揭示的 是基 因组 D N A序列 的 多态性 ，因此从 这个 意义 上 来看 ， 对黄瓜杂交种纯度进行鉴定时所选用 S S R引 物越多， 其可靠性越高， 但成本也越高。 在实际生产 中 ， 黄瓜 杂交 种 的混杂 主要 来源 于 制种 过程 中的亲 本混杂 ， 所以黄瓜杂交种的纯度鉴定主要在于鉴别 亲本 类种 子 ， 因此选 用一 对共 显性 S S R引 物就
13、可 以 达 到纯度 鉴定 的 目的 。 参考 文献 【 1 】 方宣钧 ， 刘思衡 ， 江树 业 品种纯度 和真伪的 D N A分子标 记 及其应用l J 】 农业生物技术学报 ， 2 0 0 0 ( 2 ) ： 1 0 6 - 1 1 0 2 】 戚华雄 ，Y a n g S L ， Wa n g B， 等 用 P C R技 术鉴定杂 交水 稻种子 J 】 湖北农业科学 ， 1 9 9 9 ( 1 ) ： 2 1 2 - 2 1 4 【 3 郑成超 ， 温孚江D N A分子标记技术 与作物 品种纯度鉴定 J 1 山东农业大学学报 ， 1 9 9 7 ， 2 8 ( 4 ) ： 4 9 9 5
14、 0 5 【 4 】Y a s h i t o l a J ，T h i mm u r u g a n T，S u n d a r a m，e t a 1 A s s e s s me n t o f p ur t i t y o f r i c e h y b rid u s i n g mi c r o s a t e l l i t e a nd S TS m a r k e r s J C r o p S c i e n c e ， 2 0 0 2 ， 4 2 ( 4 ) ： 1 3 6 9 1 3 7 3 【 5 】 艾呈祥 ， 余贤美 ， 刘庆忠 ， 等 利用 S S R标记鉴定西
15、瓜杂交 种纯度的研究 西北植物学报 ， 2 0 0 6 ， 2 6 ( 1 0 ) ： 2 0 0 6 _2 0 1 0 6 】 殷兆晴 ， 王玉平 ， 周黎军 ， 等 杂交 稻种子纯度 的 S S R分子 检测 及应 用研究 f J 】 西 南农 业学报 ， 2 0 0 6 ， 1 9 ( 6 ) ： 1 0 0 0 - 1 00 4 【 7 】 张桂华 与黄瓜 白粉病抗性 相关基 因紧密连 锁的分子标 记研究【 D 杨凌 ： 西北农林科技大学 ， 2 0 0 3 8 】 马蕾蕾 ， 徐世 昌 ， 曹远银 植物种子 D N A快速提取新方法 f J 1 沈阳农业大学学报 ， 2 0 0 5 ， 3 6 ( 5 ) ： 6 2 6 6 2 7
