《miR122真核表达载体的构建、体外转录及其活性的鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《miR122真核表达载体的构建、体外转录及其活性的鉴定（50页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、华中科技大学硕士学位论文miR-122真核表达载体的构建、体外转录及其活性的鉴定姓名：陈姗姗申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：陆蒙吉20080501独创性声明 独创性声明 本人郑重声明， 本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。 学位论文作者签名： 日期：2008 年 05 月 15 日 学位论文版权使用授权书 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全
2、了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在_年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期：2008 年 05 月 15 日 日期：2008 年 05 月 15 日 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2miR-122 真核表达载体的构建、体
3、外转录真核表达载体的构建、体外转录 及其活性的鉴定及其活性的鉴定 硕士研究生 陈姗姗 指导老师 陆蒙吉教授 华中科技大学同济医学院病原生物系，微生物教研室 中文摘要中文摘要 目目 的的 1. 构建肝脏特异性表达的微小 RNAmiR-122 的真核表达载体； 2. 将该重组质粒在人肝癌细胞系中转录，通过现代分子生物学技术鉴定其生物活性。 3. 利用该重组质粒初步探讨 miR-122 与乙型肝炎病毒复制之间的关系。 方方 法法 1. 真核表达载体的构建： 应用 PCR 技术，以从人类肝癌细胞中提取的基因组 DNA 为模板，获得 miR-122 的编码基因片段。根据设计的酶切位点，将其与真核表达载体
4、 pSuper 同时双酶切，然后经 T4 连接酶连接，筛选得到稳定的克隆，命名为 pHsa-m122。 2. 鉴定重组体的生物活性： 以美国斯坦福大学医学院微生物与免疫教研室 Peter Sarnow 教授馈赠的荧光报告质粒 GFP-122 sensor（GFP-122si）为报告质粒、GFP-124 sensor （GFP-124si）为无关对照质粒， 该报告质粒 GFP-122si 的转录可被成熟的 miR-122 干扰， 使绿色荧光蛋白的表达量下降， 同样 GFP-124si 的转录也可被成熟的 miR-124 干扰， 而不受成熟的 miR-122 干扰。因而将 pHsa-m122 与报
5、告质粒 GFP-122si 共同转染人肝癌华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3细胞系 HepG2，以 pHsa-m122 与参照质粒 GFP-124si 共转染人肝癌细胞系 HepG2为对照，分别用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达、流式细胞仪检测细胞的平均荧光强度、Western blot 检测绿色荧光蛋白的表达量这三种方式来检测 GFP的表达变化，通过 GFP 蛋白表达量的下降来反映成熟的 miR-122 的表达情况。 3. 初步探索 miR-122 与 HBV 复制之间的关系： 通过体外真核转染确定质粒 pHsa-m122
6、的有效性后，将 pHsa-m122 转染入人肝癌细胞系 HepG2.2.15 细胞，经过 24 小时后，用 ELISA 的方法来检测细胞分泌上清中 HBsAg、HBeAg 的表达量。 结结 果果 1. 真核表达载体的构建： pHsa-m122 经 PCR 鉴定，能够获得预期大小的目的片段； pHsa-m122 经双酶切鉴定，可获得预期大小片段； pHsa-m122 经 Invitrogen 公司测序证实，miR-122 的编码基因片段已经正确插入pSuper 载体中。 2. 载体的生物活性鉴定： 荧光、流式、Western blot 的结果均表明：pHsa-m122 与报告质粒 GFP-122
7、si共同转染人肝癌细胞系 HepG2，能够有效抑制绿色荧光蛋白的表达。因此证实pHsa-m122 可转录出具有生物活性的成熟的 miR-122； 3. 载体的初步应用： 将 pHsa-m122 转染入人肝癌细胞系 HepG2.2.15 后，检测到细胞分泌上清中的HBsAg、HBeAg 的表达量升高。 结结 论论 1. miR-122 的前体序列成功地克隆到真核表达载体 pSuper 上，miR-122 的真核表 达载体 pHsa-m122 克隆成功； 2. pHsa-m122 可以表达出具有生物活性的成熟的 miR-122； 3. 在对 miR-122 与 HBV 复制关系的初步探索中，我们的
8、实验结果提示 miR-122 可能与乙型肝炎病毒的复制有一定关系。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4miR-122 真核表达载体 pHsa-m122 的成功构建，为进一步研究 miR-122 在 肝炎病毒复制及肝癌形成中的作用奠定了实验基础。 本课题的创新点本课题的创新点 1. 在国内首次通过检测报告质粒表达绿色荧光蛋白的量的方法来检测微小 RNA 真核表达载体的生物活性，并运用荧光、流式、Western blot 的方法来鉴定出微小 RNA 真核表达载体的生物活性。 2. 在国内首次将微小 RNA 的真核表达载体运用到对乙型肝
9、炎病毒复制的研究探 索中。 关关 键键 词词 miR-122；真核表达载体；绿色荧光蛋白；乙型肝炎病毒 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 5Construction and Identification of the eukaryotic expression vector of miR-122 Candidate: Chen Shanshan Supervisor: Prof. Lu Mengji Division of Microbiology, Department of Pathogenic Biology, Tongji
10、Medical College, Huazhong University of Science and technology, Wuhan, China Abstract Objective 1. To construct the eukaryotic expression vector of miR-122 by molecular biological techniques; 2. Express this new construct in HepG2 cells, identify its biological activity; 3. Research the relationship
11、 between miR-122 and HBV using this new construction. Methods 1. The sequence encoding the mature miR-122 was amplified by PCR from the human genome DNA extracted from hepG2 cells. With the designed restriction site, digest the eukaryotic express vector pSuper and the amplified sequence, then link t
12、hem, obtain the new construction. The constructed plasmid pHas-m122 was identified by enzyme restriction and the sequencing result. 2. GFP-122si and GFP-124si were given as a present by Prof. Peter Sarnow from the Department of Microbiology and Immunology of Stanford University. The mature miR-122 c
13、ould bind the 3ORF of GFP-122si, so it could inhibit the expression of GFP, so is the relationship between miR-124 and GFP-124si, so we could co-transfect GFP-122si and pHsa-m122 into HepG2 cells, with GFP-124 as a control. Detect the expression of GFP by fluorescence, flow cytometry and western 华 中
14、 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 6blot, the decline of the expression of GFP can reflect the effect of pHsa-m122. 3. After that, we transfect pHsa-m122 into HepG2.2.15 cells, detect HBsAg and HBeAg of the cell supernatant by ELISA over 48h. Results 1. The result of enzyme restriction dig
15、estion shows what we anticipated, and the sequencing result also supported that the pro-sequence of miR-122 have been cloned into the eukaryotic expression vector pSuper successfully. 2. The results of fluorescence, flow cytometry and western blot also shows the differences of the content of GFP bet
16、ween the samples transfected with or no pHsa-m122, suggests that pHsa-m122 can express the mature miR-122 with biologic activity. 3. The content of HBsAg, HBeAg in the supernatant of HepG2.2.15 cells transfected with pHsa-m122 increased. Conclusion 1. The pro-sequence of miR-122 have been cloned into the eukaryotic expression vector pSuper successfully; 2. pHsa-m122 could express the mature miR-122 with biological activity
