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1、黄黄 曲曲 霉霉 毒毒 素素 B B1 1酶酶 联联 免免 疫疫 检检 测测 试试 剂剂 盒盒 使使 用用 说说 明明 书书样品处理方法样品处理方法一、一、食品食品 1、脂肪含量小的固体样品（如大米、玉米、小米等）称取 5.0g 样品（已粉碎）于 100ml 具塞三角瓶中，准确加入 25.0ml 甲醇水（1+1）溶液，振摇 15min，过滤，弃 去 1/4 初滤液，收集试样滤液，根据样品的国家允许量标准，用 A 试剂将滤液进行 稀释（见表 1：样品稀释表） 。将样品稀释液进行定量或限量测定。 2、 酱油、醋 称取 5.0g 样品于 25ml 小烧杯中，用 5ml 蒸馏水将试样转移到 125ml
2、 分液漏斗中，加入 20ml 三氯甲烷，加塞轻轻振摇 3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经 盛有约 5g 预先用三氯甲烷湿润的无水 Na2SO4过滤器于 100ml 蒸发皿中，再加 5ml 三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用 少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65水浴通风挥干。挥干冷却后， 准确加入 25.0ml 甲醇水（1+1） ，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。根据样品的国家 允许量标准，用 A 试剂将提取液进行稀释（见表 1：样品稀释表） 。 将样品稀释液进行定量或限量测定。 3、 食用油（如菜油、麻油、色拉油、花生油等） 称 5.0g 油样
3、于 25ml 小烧杯中，用 20ml 石油醚或正乙烷分次将试样转移至 125ml 分液漏斗中，准确加入 25.0ml 甲醇水（1+1）溶液，加塞轻轻振摇 5min，静置分 层，放出下层甲醇水提取液。根据样品的国家允许量标准，用 A 试剂将提取液进 行稀释 （见表 1：样品稀释表） 。将样品稀释液进行定量或限量测定。 4、葡萄酒准备称取 5.0g 葡萄酒于 125ml 分液漏斗中，加入 20ml 三氯甲烷，加塞轻轻振摇 3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛有约 5g 预先用三氯甲烷湿润的的无 水 Na2SO4过滤器于 100ml 蒸发皿中，再加 5ml 三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提
4、取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸 发皿中， 65水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入 25.0ml 甲醇水（1+1） ，将蒸 发皿中的凝结物充分溶解。根据样品的国家允许量标准，用 A 试剂将提取液进行稀 释（见表 1：样品稀释表） 。将样品稀释液进行定量或限量测定。 5、啤酒、黄酒准确吸取 5.0ml 样品于 25ml 容量瓶，准确加入 12.5ml 甲醇，再用蒸馏水定容至 25ml。振摇 10min，此即为待测样品液。将待测样品稀释液进行定量或限量测定。若结果为阳性，则采用葡萄酒中 AFB1的提取方法进行测定。 6、花生样品去皮粉碎（刀切或剪切） ，称取
5、 5.0g 于 100ml 具塞三角瓶中。加入 25.0ml 甲醇 水（1+1）和 20ml 正乙烷（或石油醚） ，振摇 10min，过滤于分液漏斗中，静置分层。 放出下层提取液，根据样品的国家允许量标准，用 A 试剂将提取液进行稀释（见表 1： 样品稀释表） 。将样品稀释液进行定量过限量测定。 7、月饼、桃酥、花生酱等称取 10.0g 试样于 125ml 具塞锥形瓶中，加入 50.0ml 甲醇水（1+1）提取液和 20ml 正乙烷（或石油醚）加塞震荡 15min，过滤，收集滤液于分液漏斗中，静置分层。 待下层甲醇水溶液澄清后，放出甲醇水溶液于另一锥形瓶中。准备吸取 10.0ml 甲醇水提取液
6、（相当 2.0g 样品）于 125ml 分液漏斗中，加入 20ml 三氯甲烷，加塞轻轻 振摇 3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛有约 5g 预先用三氯甲烷湿润的 无水 Na2SO4过滤器于 100ml 蒸发皿中，再加 5ml 三氯甲烷于分液漏斗中，重复振 摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并 于蒸发皿中，65水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入 10.0ml 甲醇水（1+1） ，将 蒸发皿中的凝结物充分溶解。根据样品的国家允许量标准，用 A 试剂将提取液进行 稀释（见表 1：样品稀释表） 。将样品稀释液进行定量或限量测定。 8、面粉称取 10.0g
7、面粉样于 100ml 具塞三角瓶中，准确加入 50.0ml 甲醇水（1+1）溶液， 震荡 15min ,过滤，收集试样滤液。准确吸取 10.0ml 滤液（相当于 2.0g 样品） 125ml 分液漏斗中，加入 20ml 三氯甲烷层，加塞轻轻振摇 3min，静置分层。放出 下层三氯甲烷层，经盛有约 5g 预先用三氯甲烷湿润的无水 Na2SO4过滤器于 100ml 蒸发皿中，再加 5ml 三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤 于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中， 65水浴通 风挥干。挥干冷却后，准确加入 10.0ml 甲醇水（1+1） ，将蒸发皿中的凝结物充
8、分 溶解。根据样品的国家允许量标准，用 A 试剂将提取液进行稀释（见表 1：样品 稀释表） 。将样品稀释液进行定量或限量测定。二、 饲料饲料 1、一般饲料及原料 称取 5.0g 样品于 100ml 具塞三角瓶中，准确加入 25.0ml 甲醇水（1+1）溶液，振 荡 15min，过滤，弃去初滤液。收集滤液。根据样品的国家允许量标准，用 A 试 剂将滤液进行稀释（见表 1：样品稀释表） 。将样品稀释液进行定量或限量测定。 2、饲料浓缩料 称取 10.0g 样品于 100ml 具塞三角瓶中，准确加入 50.0ml 甲醇水（1+1）溶液， 振荡 15min,过滤，收集试样过滤。 准备吸取 10.0ml
9、 甲醇水提取液（相当 2.0g 样品）于 125ml 分液漏斗中，加入 20ml 三氯甲烷，加塞轻轻振摇 3min，静置分层。 放出下层三氯甲烷层，经盛有约 5g 预先用三氯甲烷湿润的无水 Na2SO4过滤器于 100ml 蒸发皿中，再加 5ml 三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一 并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65水 浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入 10.0ml 甲醇水（1+1） ，将蒸发皿中的凝结物 充分溶解。根据样品的国家允许量标准，用 A 试剂将提取液进行稀释（见表 1：样 品稀释表） 。将样品稀释液进行定量或限量测定。 二、二、样品稀
10、释表样品稀释表 表 1 样品稀释表样品允许量（g/kg）样品提取液 （ml）A 试剂（ml）样品稀释倍数 （D）5直接量取01100.10.12150.050.23200.050.154300.050.256500.050.4510.黄曲霉毒素黄曲霉毒素 B1测试盒使用说明书测试盒使用说明书（定量检测）（定量检测）本测试盒利用固相酶联免疫吸附（ELISE）原理，通过抗黄曲霉毒素 B1抗体与酶标抗原、 待测抗原的竞争免疫反应以及酶的催化显色反应相结合来检测 AFB1，适用于食品、饲料及 相关原料中 AFB1的定量检测，特点是灵敏度高，特异性好，操作简便，结果易判读。 一、测试盒组成 1、包被抗体
11、的反应板： 48/24/12 孔 2、A 试剂：样品稀释液 1 瓶 3、B 试剂：AFB1标准溶液 1 套（0.1，0.5，1.5，10ng/ml） 4、C 试剂：酶标抗原 2/1 瓶 5、D 试剂：酶标抗原稀释液 1 瓶 6、E 试剂：浓缩洗涤液 1 瓶 7、F 试剂：显色底物液 a 1 瓶 8、G 试剂：显色底物液 b 1 瓶 9、H 试剂：终止液 1 瓶 10、反应板支架： 1 块 二、实验准备 1、 样品处理：详见“.样品处理方法” 2、 试剂的配制 每瓶 C 试剂中准确加入 1.5ml D 试剂，充分溶解，配成实验用酶标抗原溶液，2-8 保存。E 试剂用 300ml 蒸馏水配制成洗涤
12、液。 三、实验步骤 1、 试剂平衡：将测试盒取出，放置 15min 以上，平衡至室温。 2、 小孔编号：根据需要截取相当孔数放置反应板支架上。设定 1 号孔为仪器调零孔， 2 号孔为阴性孔，3-7 号孔为 AFB1标准对照孔，其余孔为样品孔。 3、 洗涤：每孔加入 250l 左右洗涤液，洗液不得溢出，放置 1min 后 甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板一次。 4、反应物组成：按下列步骤所示，依次加入配制好的溶液及待测样品稀释液。 第一步：1 号孔和 2 号孔分别加入 50l A 试剂，3-7 号控分别加入系列浓度的 B 试剂 （0.1，0.5，1，5，10ng/ml）50l,其余孔分别加入
13、相应的样品稀释液。 第二步：1 号孔加入 50lD 试剂，其余各孔均加入 50lC 试剂。 第三步：轻轻地振摇，使各孔的反应物混匀。表 2 反应物组成表孔号操作次序加入量1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 350l 50lA A 0.1 0.5 1 5 10 样 品 稀 释 液 D C C C C C C C C C C C摇匀5、反应：将反应板放入 37 恒温培养箱中孵育 30min。 6、洗涤：取出反应板，用力甩掉反应液，拍手。每孔加入 250l 左右洗涤液，洗液不得溢 出，放置 2min 后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板 4 次。 7、显色：每孔分别加入
14、显色低物液 a（F 试剂）和显色底物液 b(G 试剂)各 50l,摇匀，将 反应板放入 37 恒温培养箱中显色 15min。 8、终止与仪器测定：每孔分别加入终止液（H 试剂）50l，然后用酶测定仪（或黄曲霉毒 素 B1专用测定仪）在 450nm 波长处测定各孔的吸光度 A 值。 9、定量测定： 将浓度为 0，0.1，1，5，10ng/ml 的 AFB1系列标准工作溶液，按上述实验步骤测定相应的 吸光度 A 值，并绘制成标准曲线（见图一） 。 横坐标为标准液浓度的常用对数值（1gC） ，纵坐标为各标准液孔 A 值与标准液为 0ng/ml 的 A 值的比值（A标准液/A（0ng/ml） 。计算样
15、品孔 A 值与 A(0ng/ml)(A样品/A(0ng/ml)，查标准线，可得到相应样品稀释浓度（C）的常 用对数值 lgC，对其求反对数，可求得样品稀释液的 AFB1浓度 C。按下列公式计算出样品 中 AFB1的含量：AFB1含量（ng/g）=C(V/M)D 式中：C:稀释后样品提取液中 AFB1含量（ng/ml） V:样品提取液体积（ml）M:样品质量（g） D:样品稀释倍数 四、测试盒贮存1、2-8贮存，忌 0以下冻存。2、有效期 6 个月。 五、样品允许量标准请参阅（GB2671-81，GB8381-87） 六、批号：见测试盒. 黄曲霉毒素黄曲霉毒素 B1测试盒使用说明书测试盒使用说明书（限量检测）（限量检测）一、测试盒组成1、 包被抗体的反应板： 48/24/12 孔2、 A 试剂：样品稀释液 1 瓶
