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1、实验三实验三 食品中蛋白质含量测定食品中蛋白质含量测定( (凯氏定氮法凯氏定氮法) )实验三 食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）（50095-2003 食品中蛋白质含量测定）一、目的与要求1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。二、实验原理蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗
2、蛋白。三、仪器与试剂（一）试剂1、硫酸铜（CuSO45H20） 2、硫酸钾3、硫酸（密度为 1.8419g/L）4、硼酸溶液（20g/L）5、氢氧化钠溶液（400g/L）6、0.01mol/L 盐酸标准滴定溶液。7、混合指示试剂：0.1%甲基红乙溶液液 1 份，与 0.1%溴甲酚绿乙醇溶液 5 份临用时混合。8、黄豆粉。（二）仪器微量定氮蒸馏装置：如图 3- 所示。图 3- 微量凯氏定氮装置1、电炉； 2、水蒸气发生器（2L 平底烧瓶） ；3、螺旋夹 a；4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处） ；5、反应室；6、反应室外层；7、橡皮管及螺旋夹 b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。四、实验步骤1、样
3、品消化称取黄豆粉约 0.3g（0.001g） ，移入干燥的 100mL 凯氏烧瓶中，加入 0.2g 硫酸铜和 6g 硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL 浓硫酸，将瓶以 450 角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热 0.5h，取下放冷，小心加 20mL 水，放冷后，无损地转移到 100mL 容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至 100mL，得试剂空白消
4、化液。2、定氮装置的检查与洗涤检查微量定氮装置是否装好。在蒸气发生瓶内装水约三分之二，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。测定前定氮装置如下法洗涤 23 次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子 a，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子 b 由橡皮管排出，如此数次，即可使用。3、碱化蒸馏量取硼酸试剂 20mL 于三角瓶中，加入混合指示剂 23 滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夹 a 关闭，螺旋夹 b 开启的状态下，准确吸取 10.0mL 样品消化液，由小漏斗流入反应室
5、，并以10mL 蒸馏水洗涤进样口流入反应室，棒状玻塞塞紧。使 10mL 氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，用少量水冲洗立即将玻塞盖坚，并加水于小玻杯以防漏气，开启螺旋夹 a，关闭螺旋夹 b，开始蒸馏。通入蒸汽蒸腾 10min 后，移动接收瓶，液面离开凝管下端，再蒸馏 2min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准备滴定。同时吸取 10.0mL 试剂空白消化液按上法蒸馏操作。4、样品滴定以 0.01mol/L 盐酸标准溶液滴定至灰色为终点。5、数据记录项 目第一次第二次第三次样品消化液（mL）滴定消耗盐酸标准溶液（mL）消耗盐酸标准溶液平均值（mL）五、结果计算EMB
6、ED Equation.3 式中 X样品蛋白质含量（g/100g） ；V1样品滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL） ；V2空白滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL） ；c盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L） ；0.0140 1.0mL 盐酸 EMBED Equation.3 标准滴定溶液相当的氮的质量（g） ；m样品的质量（g） ；F氮换算为蛋白质的系数，一般食物为 6.25；乳制品为 6.38；面粉为 5.70；高梁为 6.24；花生为 5.46；米为 5.95；大豆及其制品为 5.71；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为 5.83；芝麻、向日葵 5.30。计算结果保留三位有效数字。六、注意
7、事项及说明1、本法也适用于半固体试样以及液体样品检测。半固体试样一般取样范围为 2.00g5.00g；液体样品取样 10.0mL25.0mL（约相当氮30mg40mg） 。若检测液体样品，结果以 g/100mL 表示。2、消化时，若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生。3、消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热消化至完全。4、硼酸吸收液的温度不应超过 40，否则氨吸收减弱，造成检测结果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。5、在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%七、思考题1、预习凯氏定氮法测定蛋白质的原理及操作。2、蒸馏时为什么要加入氢氧化钠溶液？加入量对测定结果有何影响？3、在蒸汽发生瓶水中、加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸的作用是什么？若在蒸馏过程中才发现蒸汽发生瓶中的水变为黄色，马上补加硫酸行吗？4、实验操作过程中，影响测定准确性的因素有哪些？*JimiSoft: Unregistered Software ONLY Convert Part Of File! Read Help To Know How To Register.*
