乙醇脱氢酶基因的克隆及转接

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1、题题 目目 乙醇脱氢酶基因的克隆及转接乙醇脱氢酶基因的克隆及转接 _姓姓 名名_邹昊天邹昊天_学学 号号_3120100160_专专 业业_应用生物科学应用生物科学_年年 级级_大三大三_乙醇脱氢酶基因的克隆及转接乙醇脱氢酶基因的克隆及转接一、一、实验背景介绍实验背景介绍 醋酸杆菌在工业生产和日常生活中，都是极为常见而重要的菌种，参与食醋酿造和维 生素 C 制造。在醋酸杆菌氧化乙醇产生乙酸的生化过程中，乙醇脱氢酶是参与发酵的一种 重要酶，其他酶种还包括乙醛脱氢酶、葡萄糖脱氢酶等。乙醇脱氢酶分布在醋酸杆菌细胞 膜和细胞质中，但膜蛋白较细胞质酶活性大得多。对于醋酸杆菌来说，细胞膜侧乙醇脱氢 酶最佳

2、 pH 为 4。 乙醇脱氢酶在生物中广泛存在，包括微生物、植物、 哺乳动物等，但微生物，尤其是 醋酸杆菌，胞内具有丰富的乙醇脱氢酶酶系，是克隆乙醇脱氢酶基因的好材料。 在巴氏醋酸杆菌中，乙醇脱氢酶以两个亚基 adh1 和 adh2 组成，因此需要克隆两个基 因，自组装后获得有活性的乙醇脱氢酶。 二、二、实验目的与意义实验目的与意义 本实验的目的是克隆巴氏醋酸杆菌 AC2005 菌株中的乙醇脱氢酶基因，利用电击法将 该基因导入农杆菌，筛选有乙醇脱氢酶活性的农杆菌菌株，并检测乙醇脱氢酶的活力。 本实验的意义在于克隆醋杆菌菌株中的 adh1 和 adh2 基因，由于农杆菌没有乙醇脱氢 酶基因，将醋杆

3、菌的乙醇脱氢酶基因导入农杆菌后，筛选乙醇脱氢酶活性高的农杆菌菌株， 可以帮助在淹水条件下无氧呼吸产生乙醇的植株根系分解乙醇，使植株抗逆性提高。 三、三、材料与方法材料与方法 实验材料：巴氏醋酸杆菌 AC2005、农杆菌 GV3101、pCAMBIA2301-ZH 质粒（含 Kpn I 酶、Sal I 酶、BamH I 酶、Hind III 酶切位点） 实验试剂：PCR 产物回收试剂盒、YEP 固体培养基、YEP 液体培养基、卡那霉素、利 福平、Kpn I 酶、Sal I 酶、BamH I 酶、Hind III 酶、T4 DNA 连接酶、dNTPs、FastPfu DNA 聚合酶、ddH2O、P

4、CR Buffer、引物 P1、P2、P3、P4（序列下述） 、琼脂糖、 EB、TBE 电泳缓冲液、NaCl、TE（pH=7.6；pH=8.0） 、苯酚、氯仿、10 Ligase Buffer、PEG 4000、IPTG、0.05mol/L 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH=8.6） 、NAD+、乙醇、 基因组 DNA 提取试剂盒 实验仪器：PCR 仪、摇床、微量移液枪（2.5uL、10uL、100uL、1000uL） 、电泳池、 恒温箱、紫外-可见分光光度计、冰箱、水浴锅等 实验基本流程：提取巴氏醋酸杆菌 AC2005 基因组 DNAPCR 扩增 adh1 基因和 adh2 基因PCR 产物回收

5、凝胶电泳检测特异条带双酶切 PCR 产物和质粒连接质粒和基因 农杆菌活化电击法导入活化的农杆菌，培养检测乙醇脱氢酶活力 实验具体操作流程： a)提取巴氏醋酸杆菌提取巴氏醋酸杆菌 AC2005 基因组基因组 DNA 1. 将 5mL 过夜培养的巴氏醋酸杆菌细胞转移到微量离心管中，12000r/min 离心 3min，收集沉淀下来的细胞。 2. 加 567ul TE 溶液悬浮沉淀，并加 30ul 10% SDS, 3ul 蛋白酶 K(20mg/ml)，混匀，37水浴保温 1 小时。 3. 加 100ul 的 5mol/L NaCl，混匀。 4. 加入 80ul CTAB/NaCl 溶液，混匀，65

6、水浴保温 10min。 5. 用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提，12000rpm 离心 3 分钟。 6. 仔细移取上清液至另一离心管中，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置 10min, 即出现絮状 DNA 沉淀。 7. 用勾状玻璃棒捞出 DNA 絮团，在 70%乙醇中漂洗后在干净吸水纸上吸干，室温下干燥后转入 100ul 的 TE 溶液中，DNA 很快溶解于 TE。保存于-20。 b)PCR 扩增扩增 adh1 基因和基因和 adh2 基因基因 乙醇脱氢酶 adh1 的克隆 引物 P1 为 5-CGGGGTACCATGACCCGCCCCGCCTCCGCCAAGA-3，下划线为 Kpn I 酶

7、切位点，引物 P2 为 5-ACGCGTCGACTTAGGGGTTAATGCCAAGTGTCG-3，下划线 为 Sal I 酶切位点。 PCR 反应体系：DNA 模板 2L；P1（20mol/L）0.5L；P2（20mol/L） 0.5L；dNTPs（2.5mmol/L each）5L；5 Buffer 10L；FastPfu DNA 聚合酶（2.5U/L） 0.5L；ddH2O 补足至 50L。反应条件：95变性 5min；（95变性 50s+50退火30s+72延伸 150s）*30 个循环；72延伸 10min。得到 PCR 产物，4保存。 乙醇脱氢酶 adh2 的克隆 引物 P3 为

8、5-CGGGATCCGATGATGATGAACAGGCTAAAAACTGC-3，下划线为 Bam H I 酶切位点，引物 P4 为 5-CCCAAGCTTTTACTGGGCTTCATCCACACCAGCA-3， 下划线为 Hind III 酶切位点。 PCR 反应体系：DNA 模板 2L；P3（20mol/L）0.5L；P4（20mol/L） 0.5L；dNTPs（2.5mmol/L each）5L；5 Buffer 10L；FastPfu DNA 聚合酶（2.5U/L） 0.5L；ddH2O 补足至 50L。反应条件：96变性 5min；（96变性 50s+55退火30s+72延伸 80s）

9、*3 个循环；（96变性 50s+57退火 30s+72延伸 80s）*4 个循环； （96变性 50s+59退火 30s+72延伸 80s）*22 个循环；72延伸 10min。得到 PCR 产 物，4保存。 c)PCR 产物回收产物回收 在 PCR 反应液中加入 100L Buffer PCR-A，混匀，转移到 DNA 制备管中，将 DNA 制备管置于 2 ml 离心管中，11000g 离心 2min，弃滤液。 将制备管置回 2 ml 离心管，加 0.7 ml Buffer W2，11000g 离心 12min，弃滤液。 注意确认在 Buffer W2 中加入无水乙醇。 将制备管置于离心管

10、中，将制备管置回 2 ml 离心管，加 0.4 ml Buffer W2，11000g 离心 2 min。 将制备管置于洁净的 1.5ml 离心管中，在 DNA 制备膜正中央加 30l 65去离子 水，室温静置 1 min。11000g 离心 2 min。再加入 10l 65去离子水，11000g 离心 2 min，洗脱 DNA。 d)凝胶电泳检测特异条带凝胶电泳检测特异条带 称取 0.8g 琼脂糖，加入 120mL 1TBE，在微波炉中加热 3min，使琼脂糖完全溶 解。 待溶液稍冷却（手触摸不烫） ，加入两滴 EB，混合均匀，倒在大槽凝胶板上。 待溶液完全凝固，小心拔出梳子，取下凝胶板，去

11、除背面多余的凝胶，将凝胶板 置于电泳仪中，使电泳液完全没过凝胶。 取 4L PCR 产物，加 0.2L Buffer，在各点样孔中加 4L 混匀溶液，在最右的点 样孔中加入 2L Marker。 设置电压为 140V，时间为 30min，电流 120mA。开启电泳仪。 待电泳结束后，小心取出凝胶，放入紫外自显影台板中，获得条带。 e)双酶切双酶切 PCR 产物和质粒产物和质粒 在 1.5mL 离心管中加入 5L 质粒、1L 10Buffer、0.2L Kpn I、0.2LSal I、3.6L 去 离子水，混匀，在 37培养箱中酶切 30min。标记为 1 号管。 在 1.5mL 离心管中加入

12、5L PCR 产物、1L 10Buffer、0.2L Kpn I、0.2LSal I、3.6L 去离子水，混匀，在 37培养箱中酶切 30min。标记为 2 号管。 在 1.5mL 离心管中加入 5L 质粒、1L 10Buffer、0.2L Bam H I、0.2L Hind III、3.6L 去离子水，混匀，在 37培养箱中酶切 30min。标记为 3 号管。 在 1.5mL 离心管中加入 5L PCR 产物、1L 10Buffer、0.2L Bam H I、0.2L Hind III、3.6L 去离子水，混匀，在 37培养箱中酶切 30min。标记为 4 号管。 f)连接质粒和基因连接质粒

13、和基因 取 1 号管 1L 溶液，与 2 号管 1L 溶液混匀，加入 1L 10 Ligase Buffer，1L 50% PEG 4000，1L T4 DNA Ligase，加无菌水到 10L，16过夜连接。 取 3 号管 1L 溶液，与 4 号管 1L 溶液混匀，加入 1L 10 Ligase Buffer，1L 50% PEG 4000，1L T4 DNA Ligase，加无菌水到 10L，16过夜连接。 g)农杆菌活化农杆菌活化 1)挑取单菌落 GV3101，接种于 5mL 附加有 50mg/L 的利福平的液体 LB 培养基中，28，200rpm，过夜； 2)取 2mL 培养物至 50

14、mL 液体 LB 培养基中，继续培养至 OD600 为 0.5 左右； 3)将培养物冰浴 30min，4，5000rpm，离心 5min，弃上清； 4)用 l0mL 0.lmol/L 冷的 NaCl 悬浮菌体；5)4，5000rpm，离心 5min，弃上清； 6)1 mL 20mmo1/L 冷的 CaCl2悬浮，分装成 50L/管，液氮速冻后，-80保存。 h)电击法导入活化的农杆菌，培养电击法导入活化的农杆菌，培养 1.0.2cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上 5 分钟，待其沥干水 分，正置 5 分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶 离冰面

15、0.5cm 以方便盖上杯盖，冰中静置 5 分钟充分降温。 2.取-80保存的农杆菌感受态插入冰中 5 分钟，待其融化，加入 5L 质粒 DNA， 用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用 200ul 枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中， 盖上杯盖，空管保留待用。 3.启动电转仪，设置参数：C=25F，PC=200ohm，V=2400V，将电击杯快速放入电 转槽中，电击完成快速插入冰中，加入 700l 无抗生素的 LB 并转移到感受态空管中，28振荡培养 23 小时。 4. 6000rpm 离心一分钟收菌，留取 100l 左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于 50g/ml 卡那霉素 YEP 平板上，倒置放于 28培养箱培养 2 天。 i)检测乙醇脱氢酶活力检测乙醇脱氢酶活力 1、 挑取克隆的菌落，接种于 YEP 液体培养基上，28 250rpm 培养至 OD600到 0.6， 加入 IPTG 至终浓度为 1mM，进行诱导表达。 2、 6000rpm 离心收集菌体。 3、 5 mL 酶活测定体系中包含 0.05 mol/L 甘氨酸-氧氧化钠缓冲液(pH