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1、荧光染料 PKH26 产品描述及使用方法产品描述：专利膜标记技术，稳定的与细胞膜脂质区结合并发出红色荧光，染色方式依赖于细胞与膜的类型，主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究及体内外细胞示示踪研究。成分：PKH26 染料 1 瓶（0.1ml，110-3 M 乙醇液中） ；稀释液 C（1 瓶10ml）.贮藏：避光冷藏，用前检查结晶，如有结晶需在 37水浴溶晶。因在乙醇中贮藏，所以要盖紧防挥发。稀释液 C：常温或冰箱保存，无防腐剂和抗生素，保持无菌。染料的工作液随用随配，不要将配好的染料贮存。步骤：所需材料：均匀的单细胞悬液；含血清培养基；无血清培养基或不含 Ca2+Mg2+的 PBS 液；血清、
2、白蛋白或与培养基兼容的蛋白源；聚丙烯锥形离心管；温度可控的离心机（0-1000g） ；荧光分析仪（荧光计，荧光显微镜，流式细胞仪，荧光图象分析仪） ；超净台；细胞计数仪；载玻片。注意：过度的细胞标记将导致膜完整性丧失、细胞数量下降。本样品细胞和染料浓度是参照浓度适合大部分细胞，但最佳染料/细胞由使用者根据细胞类型和实验目的决定，另外使用者还要评估细胞的生存力（排碘） ，荧光强度，荧光峰值的变异系数，染色的均匀性。无菌操作示范步骤（总体积 2ml，染色终浓度为 210-6M PKH26 染料和 1107 细胞/ml）：1、 胰酶和/或 EDTA 消化细胞形成单细胞悬液；2、 所有操作在 25进行
3、，2107 细胞于锥形离心管中，用无血清培养基洗一次。3、 400g 离心 5min 形成松散的细胞团。4、 吸去上清，细胞团上剩余液体5ml)或太少（100ul）的液体。避免用沾血清的移液管加染料；3） 液体量应尽可能精确以保证细胞和染料浓度被精确复制。6、 染料和稀释液作用于细胞的时间尽量短，有一定毒性。为评价损害，可用稀释液按上述步骤作用于细胞看其受损程度。7、 加等量血清终止反应，在终止染色反应前别离心稀释液 C 中的细胞，清洗时用含血清培养基可增加清洗效果。8、 细胞应单独移至新试管中离心，清洗 3 次时不用稀释液 C 而用培养基。9、 可用于体外干细胞、淋巴细胞、单核细胞、内皮细胞
4、等的标记较理想。10、 全细胞标记应先于单抗染色的标记，当 4单抗染色时细胞跟踪探针将保持稳定；如后于单抗染色的标记，很可能出现“盖帽”现象。11、 染色细胞用 2%多聚甲醛固定稳定性达 3w 以上。12、 血小板标记时方法要作修改。组织学：制备和保存含 PKH 标记细胞切片时要冰冻切片和特殊的封固标本技术。切片制备：1、 切除组织后立即放入干冰冰冻。2、 切片前-70保存。3、 用 OCT（Tissue-Tek; Miles, INC.）复合物制作冰冻切片。4、 4-5um 组织切片。5、 载玻片室温下干燥 1h。6、 封固盖玻片用 1-2 滴氰基丙烯酸盐粘合剂酯胶。7、 检查和拍片时用标准的滤光器如 FITC(PKH2 和 PKH67)或 TRITC（PKH26） 。复染切片：1、 将玻片浸在丙酮液 24-48h，去除盖片；2、 蒸馏水清洗去丙酮；3、 复染切片易用 Mayer 或 Harris 苏木精；4、 封固载玻片用 AS/AP 永久性水合封固液（Bio/Can America, Inc.，Porland, ME）注意：由于有机溶剂可析取 PKH 染液，而复染又吸收荧光，因而同时观察组织学和 PKH 荧光不可取。希望能有用！
