《玉米抗旱相关基因zmvha-a和zmvha-b的克隆及表达分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《玉米抗旱相关基因zmvha-a和zmvha-b的克隆及表达分析（61页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、四川农业大学硕士学位论文玉米抗旱相关基因ZmVHA-A和ZmVHA-B的克隆及表达分析姓名：毛毅辉申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：荣廷昭;王天宇20070501摘要植物v 二A 1 P a s e 是一类特殊的膜结合转运蛋白，广泛分布于植物的液泡、质膜以及内质网、高尔基体、小泡等内膜系统上。它的主要功能是催化水解A T P ，跨细胞内膜系统建立质子电化学梯度，为次级转运提供动力，推动相关离子和小分子代谢产物进行跨膜转运。在植物的生长发育及适应环境的变化中具有重要的作用。尽管目前对于V - A T P a s e 的结构和亚基组成己作了大量研究，编码亚基的基因也已经从许多植
2、物中克隆，但是关于V - A T P a s e 亚基基因在不同逆境下的表达与调控的研究鲜有报道。且在本实验室的前期研究中发现V - A T P a s e 亚基A 基因( z m w 烈卅)受干旱胁迫诱导表达。基于此本研究采用R A C E 技术对玉米V - A T P a s eA 亚基基因( Z w 删Z 卅) 进行了克隆，分析了Z m V H A - , 4 基因在苗期水分胁迫，盐胁迫、冷胁迫、外源A B A 和花期水分胁迫下的表达特征；同时对V - A T P a s e 的另一个关键亚基B 基因( z 晰阡M 国) 进行了克隆，并对Z m V H A - B 基因在苗期水分胁迫，盐
3、胁迫、冷胁迫、外源A B A 和花期水分胁迫下的表达特征也进行了分析；力图通过对其关键亚基基因的分析阐释V - A T P a s e 在逆境下的调节及响应机制。同时构建Z m V H A - 4 ：G F P 融合表达载体转化洋葱表皮细胞，对亚基A 进行了亚细胞定位的研究。最后把Z m V H A - A 基因融合在3 5 S 启动子之下构建了过表达载体，并转化拟南芥进行过表达分析。主要研究结果如下：1 利用R A C E ( R a p i d A m p l i f i c a t i o n o f e D N A E n d s ) 策略，扩增出Z m V H A - A 基因的5
4、端和3 端序列，然后用R T - P C R 扩增Z m V H A - , 4 编码框c D N A 序列，编码区长1 8 6 3 b p ，编码6 2 0 个氨基酸，推测分子量为6 9 K D a ，等电点为5 3 6 。同时通过R T P C R 获得Z m V H A - B 基因的编码区序列，序列分析表明：该基因编码4 8 7 个氨基酸，蛋白分子量为5 4 0 9 k D 等电点为4 9 9 。2 氨基酸同源性分析和聚类分析表明V - A T P a s eA 和B 亚基都是高度保守的蛋白亚基，且不同物种的V A T P a s e 亚基A 和B 的同源性高低与生物进化具有高度的相关
5、性。结构预测结果表明A 亚基上存在两个保守的功能结构域，B 亚基上也同样存在它发挥调节作用所必需的保守功能结构域。3 G F P 融合标记法对Z m V H A - A 进行定位分析，结果表明：当G F P 单独转化洋葱表皮细胞时，G F P 蛋白在洋葱表皮细胞膜、细胞质和细胞核中表达；而融合蛋白在洋葱表皮细胞的胞质中表达，表明Z m V H A - 4 基因主要在细胞胞质中表达，这一结果与前I入研究结采一致。4 N o r t h e r n 杂交结采表甥玉米飙玲班捌羁Z m V H A - B 基阂在花期农分黪涟下芘丝中被诱导袭达，在苗期Z m V H A - A 和Z m V H A -
6、 B 基因也对干旱、高盐、低温胁迫和A B A赴耀也骰獭了确瘦，V - A T P a s e 基觳在这些耱遥过程孛可麓遽避参鸯菜些笑丽豹谲节通路参与逆境胁迫响应。弦苗期2 抽肼埘卅和劢盼绷一B 基因都对( 午旱) 水分胁迫作窭了响应，它稻静表达与汁片稻辩含水量并不成一一对应关系；Z m V H A - A 和Z m V H A - B 这两个基因都可被外源A B A 诱导表达。Z r n V H A B 基因在蔼期干旱和毫盐下的叶子中和花期干旱下的花丝中存在着双转录本的诱导表j 纛，这些同工型的诱导表达可能在逆境条传下发撂考羹要功熊。关键锈：V - A T P a s e ，Z m V H
7、A - A ，Z m V H A - B ，克隆，表达分静予I IA b s t r a c tM a oY i H u i ( B i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y )D i r e c t e db yP r o f _ R o n gT i n gZ h a oT h ep l a n tV - A T P a s ei sam e m b r a n e - b o u n dt r a n s p o r tp r o t e i nl o c a t e dt ot h et o n o p l a s
8、 ta n dv a r i o u ss u b c e l l u l a rm e m b r a n e s ，i n c l u d i n gt h eG o l g i ，e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m , i n t r a c e l l u l a rv e s i c l e s ，a sw e l la st h ep l a s m am e m b r a n eT h eV - A T P a s eU S e St h ee n e r g yr e l e a s e dd u r m gc l e a v a g
9、 eo f t h eT - p h o s p h a t eg r o u po fe y t o s o l i eA T Pt op u m pp r o t o n si n t ot h ev a c u o l a rl u m e na n da c i d i f yt h ev a c u o l e ，t h e r e b yc r e a t i n ga ne l e c t r o c h e m i c a lH + - g r a d i e n tw h i c hi st h e 血v 1 1 1 9f o r c ef o rav a r i e t y
10、o fu t n s p o r te v e n t so fi o n sa n dm e t a b o l i t e sS oV - A T P a s ei si n d i s p e n s a b l ef o rp l a n tg r o w t h , d e v e l o p m e n ta n da d a p t a t i o nt oc h a n g i n ge n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n sA l t h o u g hg e n e se n c o d i n gV - A T P a s e
11、s u b u n i t sh a v eb e e nd e t e c t e di nm a n yp l a n t s ，a n dW ek n e wi t ss t r u c t u r ea n dc o m p o s i t i o n , B u te x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o no fV - A T P a s eo n l yh a dal i t t l er e p o r tI nt h ee a r l ys t a g e o f o n rr e s e a r c h w e f o u n d
12、t h a t e x p r e s s i o n o f v a c u o l a r H - - A T P a s es u b u n i t A g e n e W a S i n d u c e di nd r o u g h ts l r e s sB a s e dO i lao n i E S Tf r o maS S Hl i b r a r yb u i l tf r o mm a i z ei n b r e dl i n e “C N l 6 5 ”u n d e rd r o u g h ts t r e s s t h ec o m p l e t ee D
13、 N As e q u e n c eo fV H A - Ag e n e ( v a c u o l a rH - A T P a s es u b u n i tA ) f r o mC N l 6 5 ，n a m e dZ m V H A - A ，w a so b t a i n e du s i n gR A C E ( R a p i dA m p l i f i c a t i o no fe D N AE n d s ) t e c h n i q u ea n db yu s 啦R T - P C Rw ea l s og o tZ m V I - I A - Bg e
14、n ee u c e d m gV - A T P a s eBs u b u n i t ，T oe l u c i d a t ei t sr e g u l a t i o na n dr e s p o n s et oe n v i r o n m e n t a ls t r e s s ，N o r t h e r nb l o t t i n ga n a l y s i so f Z m V H A - Aa n dZ m V I t A - Bg e n e sW a sc a r r i e do u tu n d e rw a t e rs t r e s s ，s a
15、 l tS t r e s s ，c o l ds t r e s sa n de x o g e n o u sA B Ai ns e e d l i n gs t a g ea n du n d e rd r o u g h ts t r e s smf l o w e r i n gs t a g et h e nw ep e r f o r m e dt h es u b c e l l u l a rl o c a l i z a n o nr e s e a r c hb yu s m st h ef u s ee x p r e s s i o na n a l y s i so
16、 fZ m V H A - Aa n dG F Pi no n i o ne p i d e r m a lc e l l sF i n a l l yo v e r e x p r e s s i o no f Z m V t t A - Ag e n eW a se a r n e do u ti nA r a b i d o p s i st h a l i a n a T h em a r e 丘n d i l g sw e r ea sf o l l o w s ：1 u s i n g R A C E ( R a p i d A m p l i f i c a t i o n o f e D N A E n d s ) s t r a t e g y ，w e g o t a l l l e n g t h e D N As e q u e n c e o fZ m V H A - Ag o n e ，a n dS e q u e n c ea n a l y s i si n d i c a t e dt h ef u l l
