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1、迁移实验（迁移实验（cell migration assay）实验材料实验材料（1）Transwell chamber: 24-well, 8.0-m pore membranes (Corning) （2）细胞培养相关试剂：无血清培养基，10血清培养基，PBS，0.02EDTA（3）固定液：甲醇（4）染色液：Giemsa 染液（5）封片剂：中性树胶（6）其他：小镊子，棉棒，载玻片，盖玻片操作步骤操作步骤（1）所有细胞培养试剂和 Transwell chamber 放在 37温育；（2）待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用 PBS 和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调
2、整浓度为 2105 /ml；（3）在下室（即 24 孔板底部）加入 600800l 含 10血清的培养基，上室加入 100150l 细胞悬液，继续在孵箱培养 24 小时；（4）用镊子小心取出 chamber，吸干上室液体，移到预先加入约 800l 甲醇的孔中，室温固定 30 分钟；（5）取出 chamber，吸干上室固定液，移到预先加入约 800l Giemsa 染液的孔中，室温染色 1530 分钟；（6）轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出 chamber，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞；（7）用小镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树胶封片；（8）显微镜下取 9
3、个随机视野计数，统计结果。注意事项注意事项（1）根据待测细胞体积大小选择合适孔径的 chamber。常用的为 8.0-m 孔径（如 AGS 细胞） ，如果细胞体积较大可以考虑用 10-m 孔径；（2）根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。常规 24-well chamber 接种细胞数约为 25104/well，迁移时间 1236 小时；（3）由于 Corning 公司的 24-Transwell 内含 12 个独立的 chamber，为了避免操作污染，每次实验可预先另准备一块 24 孔普通培养板（Corning） ；（4）如果细胞迁移能力较弱，下室液体可用 3T3 细胞无血清培养
4、24 小时获得的上清加 50g/ml FN（Fibronectin） ，具体可查阅相关文献；（5）细胞悬液加入膜中央，尽量保证液面水平；（6）固定染色擦洗时动作小心，避免擦去膜底面的细胞。但一定要充分擦净膜表面上未迁移的细胞，以免影响读数。尤其是膜周边上可用细牙签或小镊子缠上湿棉花擦洗，但要小心避免将膜戳破；（7）Chamber 和膜上都无法标记，操作时应小心避免混淆实验组和对照组；（8）充分晾干，避免残留水分导致镜下聚焦不一致。细胞侵袭实验细胞侵袭实验 （cell invasion assay）实验材料实验材料（1）Matrigel (BD 5mg/ml)，-20保存（2）其余材料同迁移实验操作步骤操作步骤（1）Matrigel 在 4过夜融化；（2）用 4预冷的无血清培养基稀释 Matrigel 至终浓度 1mg/ml，冰上操作；（3）在 chamber 上室底部中央垂直加入 100l 稀释后的 Matrigel，37温育 45 小时使其干成胶状；（4）后续步骤同迁移实验（1-8） 。注意事项注意事项（1）Matrigel 在过高或过低的温度均易凝固，因此操作所需枪头和离心管应提前在 4预冷；（2）铺胶时保证液面水平，胶的厚度均匀一致，切勿产生气泡；（3）其他注意事项同迁移试验。
