《迁移侵袭试验 实验室技术》由会员分享,可在线阅读,更多相关《迁移侵袭试验 实验室技术(2页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、迁移实验(迁移实验(cell migration assay)实验材料实验材料(1)Transwell chamber: 24-well, 8.0-m pore membranes (Corning) (2)细胞培养相关试剂:无血清培养基,10血清培养基,PBS,0.02EDTA(3)固定液:甲醇(4)染色液:Giemsa 染液(5)封片剂:中性树胶(6)其他:小镊子,棉棒,载玻片,盖玻片操作步骤操作步骤(1)所有细胞培养试剂和 Transwell chamber 放在 37温育;(2)待测细胞培养至对数生长期,消化细胞,用 PBS 和无血清培养基先后洗涤一次,用无血清培养基悬浮细胞,计数,调
2、整浓度为 2105 /ml;(3)在下室(即 24 孔板底部)加入 600800l 含 10血清的培养基,上室加入 100150l 细胞悬液,继续在孵箱培养 24 小时;(4)用镊子小心取出 chamber,吸干上室液体,移到预先加入约 800l 甲醇的孔中,室温固定 30 分钟;(5)取出 chamber,吸干上室固定液,移到预先加入约 800l Giemsa 染液的孔中,室温染色 1530 分钟;(6)轻轻用清水冲洗浸泡数次,取出 chamber,吸去上室液体,用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞;(7)用小镊子小心揭下膜,底面朝上晾干,移至载玻片上用中性树胶封片;(8)显微镜下取 9
3、个随机视野计数,统计结果。注意事项注意事项(1)根据待测细胞体积大小选择合适孔径的 chamber。常用的为 8.0-m 孔径(如 AGS 细胞) ,如果细胞体积较大可以考虑用 10-m 孔径;(2)根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。常规 24-well chamber 接种细胞数约为 25104/well,迁移时间 1236 小时;(3)由于 Corning 公司的 24-Transwell 内含 12 个独立的 chamber,为了避免操作污染,每次实验可预先另准备一块 24 孔普通培养板(Corning) ;(4)如果细胞迁移能力较弱,下室液体可用 3T3 细胞无血清培养
4、24 小时获得的上清加 50g/ml FN(Fibronectin) ,具体可查阅相关文献;(5)细胞悬液加入膜中央,尽量保证液面水平;(6)固定染色擦洗时动作小心,避免擦去膜底面的细胞。但一定要充分擦净膜表面上未迁移的细胞,以免影响读数。尤其是膜周边上可用细牙签或小镊子缠上湿棉花擦洗,但要小心避免将膜戳破;(7)Chamber 和膜上都无法标记,操作时应小心避免混淆实验组和对照组;(8)充分晾干,避免残留水分导致镜下聚焦不一致。细胞侵袭实验细胞侵袭实验 (cell invasion assay)实验材料实验材料(1)Matrigel (BD 5mg/ml),-20保存(2)其余材料同迁移实验操作步骤操作步骤(1)Matrigel 在 4过夜融化;(2)用 4预冷的无血清培养基稀释 Matrigel 至终浓度 1mg/ml,冰上操作;(3)在 chamber 上室底部中央垂直加入 100l 稀释后的 Matrigel,37温育 45 小时使其干成胶状;(4)后续步骤同迁移实验(1-8) 。注意事项注意事项(1)Matrigel 在过高或过低的温度均易凝固,因此操作所需枪头和离心管应提前在 4预冷;(2)铺胶时保证液面水平,胶的厚度均匀一致,切勿产生气泡;(3)其他注意事项同迁移试验。