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1、常用设备常用设备 一.准备室的设备:单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜(放置未消毒物品)、储品规(放置消毒过的物品)、包装台。配液室的设备:扭力天平和电子天平(称量药品)、PH 计(测量培养用液 PH 值)、磁力搅拌器(配置溶液时搅拌溶液)。二.培养室的设备:液氮罐、储品柜(存放杂物)、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱(-80)、空调、二氧化碳缸瓶、边台(书写实验记录)。必须放在无菌间的设备:离心机(收集细胞)、超净工作台、倒置显微镜、CO2 孵箱(孵育培养物)、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4冰箱(放置 serum 和培养用液)。无菌操作无菌操作无菌室的灭菌:1.定
2、期打扫无菌室:每周打扫一次,先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等,然后用 3来苏尔或者新洁尔灭或者 0.5过氧乙酸擦拭。2.CO2 孵箱(培养箱)灭菌:先用 3新洁尔灭擦拭,然后用 75酒精擦拭或者 0.5过氧乙酸,再用紫外灯照射3.实验前灭菌:打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各 20-30 分钟4.实验后灭菌:用 75酒精(3新洁尔灭)擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。实验人员的无菌准备:1.肥皂洗手。2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用 75酒精棉球擦净双手。无菌操作的演示:1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75酒精擦拭瓶子的外表面
3、2.靠近酒精灯火焰操作。3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿(如瓶盖、滴管)要放在高处,使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯,动作要轻、准确,不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管,防止交叉污染。器械的清洗和消毒器械的清洗和消毒玻璃器械洗消:(1)新的玻璃器皿的洗消:1.自来水刷洗,除去灰尘。2.烘干、泡盐酸:烤箱中烘干,然后再浸入 5稀盐酸中 12 小时以除去脏物、铅、砷等物。3.刷洗、烘干:12 小时后立即用自来水冲洗,再用洗涤剂刷洗,自来水冲干净后用烤箱烘干。4.泡酸、清洗:用清洁液(重铬酸钾 120g:浓硫酸 200ml:蒸馏水 1000m
4、l)浸泡 12 小时,然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗 15 次,最后蒸馏水冲洗 3-5 次和用双蒸水过 3 次。5.烘干、包装:洗干净后先烘干,然后用牛皮纸(油光纸)包装。6.高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子,打开开关和安全阀,当蒸气成直线上升时,关闭安全阀,当指针指向 15 磅时,维持 20-30 分钟。7.高压消毒后烘干(2)旧的玻璃器皿的洗消:1刷洗、烘干:使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中,泡过来苏尔溶液(洗涤剂)的器皿要用清水刷洗干净,然后烘干。2.泡酸、清洗:烘干后泡入清洁液(酸液),12 小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗(避免蛋白质干涸后粘附于玻璃
5、上难以清洗),再用蒸馏水冲洗 3 次。3.烘干、包装:洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸(油光纸)等包装,以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。4.高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内,盖好盖子,打开开关和安全阀,随着温度的上升安全阀冒出蒸气,当蒸气成直线冒出 3-5 分钟后,关闭安全阀,气压表指数随之上升,当指针指向 15 磅时,调节电开关维持 20-30 分钟即可。(玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上)5.烘干备用:因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿,所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消:金属器皿不能泡酸,洗消时可先用洗涤剂刷洗,后用自来水冲干净,然后用 75酒精擦拭,再用自来水,然后用蒸馏水冲洗,
6、再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内 15 磅高压(30 分钟)消毒,再烘干备用。(3)橡胶和塑料:橡胶和制品通常处理方法是:先用洗涤剂洗刷干净,再分别用自来水和蒸馏水冲干净,再用烤箱烘干,然后根据不同品质进行如下的处理程序:1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用 NaOH 泡 6-12 小时,或者煮沸 20 分钟,在包装之前要装好滤膜两张,安装滤膜时注意光面朝上(凹向上),然后将螺旋稍微拧松一些,放入铝盒中在高压锅内15 磅 30 分钟消毒,再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。2. 胶塞烘干后用 2氢氧化钠溶液煮沸 30 分钟(用过的胶塞只要用沸水处理 30 分钟)
7、,自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。3. 胶帽,离心管帽烘干后只能在 2氢氧化钠溶液中浸泡 6-12 小时(切记时间不能过长),自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。4. 胶头可用 75酒精浸泡 5 分钟,然后紫外照射后使用即可。5.塑料培养瓶,培养板,冻存管:6.其他消毒方法:有的物品既不能干燥消毒,又不能蒸气消毒,可用 70酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子,放在超净台台面上,直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品
8、,消毒后需要用 23 周时间洗除残留的氧化乙烯。用 20000100000rad 的 r 射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆,可在纸包装后,用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水,在包装纸上作一记号,平时_这种墨水不带痕迹,一经高温,即出现字迹,从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制:氯化钻(CoC126H2o)2g,30盐酸 10m1,蒸馏水 88m1。注意事项:1.严格执行高压锅的操作规程:高压消毒时,先检查锅内是否有蒸馏水,以防高压时烧干,水不能过多因为其将使空气流畅受阻,会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅,以防高压时爆炸。2.安装滤膜时
9、注意光面朝上:注意滤膜光滑一面是正面,要朝上,否则起不到过滤的作用。3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡:A.泡酸时要戴耐酸手套,防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面,会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全,不能留有气泡,以防止泡酸不彻底。细胞培养用液的配制与消毒细胞培养用液的配制与消毒 器材与试剂:干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH 计、磁力搅拌器。具体步骤:一. 水的制备:细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水二.PBS 的制备与消毒(也可用于其它 BSS,如:Hanks,D-Hanks 液
10、的配制):1.溶解定容:将药品(NaCl 8.0g,KCl 0.2g,Na2HPO4H2O 1.56g,KH2PO40. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至 1000ml,摇匀即成新配制的 PBS 溶液。2.移入溶液瓶内待消毒:将 PBS 倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内 8 磅消毒 20 分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。三. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒:胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,
11、在 pH 为 8.0、温度为 37时,胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。因 Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2+、Mg2+的 BSS,如:D-Hanks 液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。1.称取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液浓度为 0.25,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调 PH 到 7.2 左右)或 PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀,置于 4内过夜。2.用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22 微米
12、微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20保存以备使用。四.青、链霉素溶液的配制与消毒1. 所用纯净水(双蒸水)需要 15 磅高压 20 分钟灭菌。2. 具体操作均在超净台内完成。青霉素是 80 万单位/瓶,用注射器加 4ml 灭菌双蒸水。链霉素是 100 万单位/瓶,加 5ml 灭菌双蒸水,即每毫升各为 20 万单位。3. 使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为 100 单位/ml。1 单位1 微克?五.RPMI1640 的制备与消毒:1.溶解、调 PH 值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3 的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋 2-3 次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂
13、全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各 0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100 单位/ml。然后用一个当量的盐酸和 NaOH 调 PH 到 7.2 左右。最后定容至 1000ml,摇匀。2.安装蔡式滤器:安装时先装好支架,按规定放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。3.抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。4.分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于 4冰箱内待用。5.使用前要向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液(4时两周有效)。六血清的灭火:细胞培养常用
14、的是小牛血清,新买来的血清要在 56水浴中灭火 30 分钟后,再经过抽滤方可加入培养基中使用。七.HEPES 溶液:HEPES 的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N-a-hydroxythylpiperazine-N- ethanesulfanic acid )。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的 pH 范围。使用终浓度为 10-50mmol/L,一般培养液内含 20mmol/LHEPES 即可达到缓冲能力。1mol/L HEPE 缓冲液配制方法如下:准确称取 HEPTS 238.3g,加入新鲜三蒸水定容至 1L。过滤除菌,分装后 4保存。注意:因为现在市售 HEPES
15、 为约 10g 包装的小瓶,所以可根据实际情况灵活配制,但是要保证培养液内 HEPES 的终浓度仍然为 20m mol/L 。如:称取 4.766 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水中,过滤除菌后可完全(20ml)加入 1L 培养液中,或者每 100ml 培养液中加入 2ml 即可。八.谷氨酰胺:合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4下放置 1 周可分解 50,故应单独配制,置于-20冰箱中保存,用前加入培养液。加有谷氨酰胺的
16、培养液在 4冰箱中储存 2 周以上时,应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为 14mmol/L。可以配制200mmol/L 谷氨酰胺液贮存,用时加入培养液。配制方法为,谷氨酰胺 2.922g 溶于三蒸水加至100ml 即配成 200mmol/L 的溶液,充分搅拌溶解后,过滤除菌,分装小瓶,-20保存,使用时可向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液。九.肝素溶液的配制:含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高,肝素加入全培养液中最终浓度为 50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠,包装为约为 0.56 克/瓶,配制时,可将其溶于 100ml 三蒸水中,定容,过夜,然后过滤除菌,分装小瓶,保存温度为。使用时,向 100ml 培养液中加入 1ml(精确可加入 0.9ml)即可。十. 型胶原酶:0.1型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意:因为型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入 10ml 小瓶-20保存。十一.明胶溶液:因为明胶