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1、常用设备常用设备 一.准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH 计（测量培养用液 PH 值）、磁力搅拌器（配置溶液时搅拌溶液）。二.培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2 孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4冰箱（放置 serum 和培养用液）。无菌操作无菌操作无菌室的灭菌：1.定
2、期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用 3来苏尔或者新洁尔灭或者 0.5过氧乙酸擦拭。2.CO2 孵箱（培养箱）灭菌：先用 3新洁尔灭擦拭，然后用 75酒精擦拭或者 0.5过氧乙酸，再用紫外灯照射3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各 20-30 分钟4.实验后灭菌：用 75酒精（3新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用 75酒精棉球擦净双手。无菌操作的演示：1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75酒精擦拭瓶子的外表面
3、2.靠近酒精灯火焰操作。3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。器械的清洗和消毒器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：（1）新的玻璃器皿的洗消：1.自来水刷洗，除去灰尘。2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入 5稀盐酸中 12 小时以除去脏物、铅、砷等物。3.刷洗、烘干：12 小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾 120g：浓硫酸 200ml：蒸馏水 1000m
4、l）浸泡 12 小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗 15 次，最后蒸馏水冲洗 3-5 次和用双蒸水过 3 次。5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向 15 磅时，维持 20-30 分钟。7.高压消毒后烘干（2）旧的玻璃器皿的洗消：1刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12 小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃
5、上难以清洗），再用蒸馏水冲洗 3 次。3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出 3-5 分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向 15 磅时，调节电开关维持 20-30 分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消：金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用 75酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，
6、再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内 15 磅高压（30 分钟）消毒，再烘干备用。（3）橡胶和塑料：橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用 NaOH 泡 6-12 小时,或者煮沸 20 分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15 磅 30 分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。2. 胶塞烘干后用 2氢氧化钠溶液煮沸 30 分钟（用过的胶塞只要用沸水处理 30 分钟）
7、，自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在 2氢氧化钠溶液中浸泡 6-12 小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。4. 胶头可用 75酒精浸泡 5 分钟，然后紫外照射后使用即可。5.塑料培养瓶，培养板，冻存管：6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用 70酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品
8、，消毒后需要用 23 周时间洗除残留的氧化乙烯。用 20000100000rad 的 r 射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时_这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻(CoC126H2o)2g，30盐酸 10m1，蒸馏水 88m1。注意事项：1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。2.安装滤膜时
9、注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。细胞培养用液的配制与消毒细胞培养用液的配制与消毒 器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH 计、磁力搅拌器。具体步骤：一. 水的制备：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水二.PBS 的制备与消毒(也可用于其它 BSS，如：Hanks，D-Hanks 液
10、的配制)：1.溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4H2O 1.56g，KH2PO40. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至 1000ml，摇匀即成新配制的 PBS 溶液。2.移入溶液瓶内待消毒：将 PBS 倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内 8 磅消毒 20 分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。三. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，
11、在 pH 为 8.0、温度为 37时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因 Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2+、Mg2+的 BSS，如：D-Hanks 液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为 0.25，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调 PH 到 7.2 左右）或 PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于 4内过夜。2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22 微米
12、微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20保存以备使用。四.青、链霉素溶液的配制与消毒1. 所用纯净水（双蒸水）需要 15 磅高压 20 分钟灭菌。2. 具体操作均在超净台内完成。青霉素是 80 万单位/瓶，用注射器加 4ml 灭菌双蒸水。链霉素是 100 万单位/瓶，加 5ml 灭菌双蒸水，即每毫升各为 20 万单位。3. 使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为 100 单位/ml。1 单位1 微克？五.RPMI1640 的制备与消毒：1.溶解、调 PH 值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3 的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋 2-3 次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂
13、全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各 0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100 单位/ml。然后用一个当量的盐酸和 NaOH 调 PH 到 7.2 左右。最后定容至 1000ml，摇匀。2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于 4冰箱内待用。5.使用前要向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液（4时两周有效）。六血清的灭火：细胞培养常用
14、的是小牛血清，新买来的血清要在 56水浴中灭火 30 分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。七.HEPES 溶液：HEPES 的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N-a-hydroxythylpiperazine-N- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的 pH 范围。使用终浓度为 10-50mmol/L，一般培养液内含 20mmol/LHEPES 即可达到缓冲能力。1mol/L HEPE 缓冲液配制方法如下：准确称取 HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至 1L。过滤除菌，分装后 4保存。注意：因为现在市售 HEPES
15、 为约 10g 包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内 HEPES 的终浓度仍然为 20m mol/L 。如：称取 4.766 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入 1L 培养液中，或者每 100ml 培养液中加入 2ml 即可。八.谷氨酰胺：合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4下放置 1 周可分解 50，故应单独配制，置于-20冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的
16、培养液在 4冰箱中储存 2 周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为 14mmol/L。可以配制200mmol/L 谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺 2.922g 溶于三蒸水加至100ml 即配成 200mmol/L 的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20保存，使用时可向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液。九.肝素溶液的配制：含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为 50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为 0.56 克/瓶，配制时，可将其溶于 100ml 三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为。使用时，向 100ml 培养液中加入 1ml（精确可加入 0.9ml）即可。十. 型胶原酶：0.1型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入 10ml 小瓶-20保存。十一.明胶溶液：因为明胶
