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1、仪器工作原理、软件操作和定量仪器工作原理、软件操作和定量PCR理论理论Module1：定量：定量PCR介绍介绍2定量定量定量定量PCRPCR是什么是什么是什么是什么? ?一种实时监控目的基因一种实时监控目的基因PCR扩增的技术扩增的技术3定量定量定量定量PCRPCR如何工作如何工作如何工作如何工作? ? 与传统PCR一样用同样的基本成分(双链DNA,引物 ,dNTPs,PCR buffer,Taq酶等等)TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCA ACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAAT
2、CTACAAACCGTMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+T AC GGAGCTGA4定量定量定量定量PCRPCR如何工作如何工作如何工作如何工作? ? 与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行: 双链DNA模板变性 引物与模板退火 引物延伸? 新的扩增片段一个PCR循环理论上每经过一个 循环目的基因的数 量都会增加一倍例如:5定量定量定量定量PCRPCR如何工作如何工作如何工作如何工作? ? PCR反应液加入了各种类型的荧光染料6定量定量定量定量PCRPCR仪器仪器仪器仪器 无论是哪个型号,所有的定量PCR仪器都有三个共同 的组成部分: 1. 热循环模块2. 光源3. 检测器7
3、PCRPCR大量大量PCR产物产物PCR 产物定量定量定量定量PCRPCR如何工作如何工作如何工作如何工作? ? 在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强8定量定量定量定量PCRPCR如何工作如何工作如何工作如何工作? ? 每个循环结束后,定量PCR仪器通过不同的滤光片记录荧光信 号的增加循环循环1滤光片滤光片 A样品样品 1Level:9 最后,定量PCR软件计算出数据，用于实验结果的分析101 copy10 copies100 copies1000 copies敏感度高: 可以检测低拷贝的目的基因为什么要用定量为什么要用定量为什么要用定量为什么要用定量PCR?PCR?11为什么要用
4、定量为什么要用定量为什么要用定量为什么要用定量PCR?PCR?扩增曲线:单拷贝扩增,4个重复有2个成功,典型的单拷贝检测(如果有足够的重复运行,泊松分布显示63%有扩增)100100010112为什么要用定量为什么要用定量为什么要用定量为什么要用定量PCR?PCR? 定量能力: 简单的流程就能得到高质量的定量数据13为什么要用定量为什么要用定量为什么要用定量为什么要用定量PCR?PCR?9 logs 动力学范围宽: 约9个数量级14为什么要用定量为什么要用定量为什么要用定量为什么要用定量PCR?PCR? 快: 节省时间和劳力(不需要电泳检测!).15为什么要用定量为什么要用定量为什么要用定量为
5、什么要用定量PCR?PCR? 安全: 不用EB或放射性物质EtBr16平台期线性增长期指数增长期循环数循环数PCR 产物产物PCR的扩增阶段为什么要用定量为什么要用定量为什么要用定量为什么要用定量PCR?PCR?17可变的平台期高精度 96 次重复次重复循环数循环数整个指数增长期表现高精度PCR 产物产物为什么要用定量为什么要用定量为什么要用定量为什么要用定量PCR?PCR?琼脂糖胶上终 点分析结果18定量定量定量定量PCRPCR的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理19两种化学方法两种化学方法两种化学方法两种化学方法染料法染料法染料法染料法TaqManTaqMan探针法探针法探针法探针法2
6、0TaqManTaqMan水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理一对PCR引物21TaqManTaqMan水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理引物之间一条寡核苷酸，称作探针22报告基团报告基团淬灭基团淬灭基团TaqManTaqMan水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理23无荧光信号产生能量激发光完整的探针：5端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的 3端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移，FRET）TaqManTaqMan水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理24Light energyT
7、aqManTaqMan水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理25变性变性 (95(95 C)C)26退火退火 (60(60 C)C)272829303132?33Taq is special . . . 5-3外切酶活性 将探针5端连接的荧光基团从探针上 切割下来3435363738394041424344454647484950515253Burp!54每个循环后每个循环后每个循环后每个循环后 . . . . . . . . . 理论上,反应管中目的基因数量增加一倍. 报告基团荧光信号按照相应的比例增加. 荧光信号的增加可以在扩增曲线图上看到. 55定量扩增检测定量
8、扩增检测定量扩增检测定量扩增检测荧光56探针引物推荐的浓度探针引物推荐的浓度探针引物推荐的浓度探针引物推荐的浓度探针: 200-250 nM (终浓度)引物: 每条引物为900nM57引物和探针的引物和探针的引物和探针的引物和探针的TmTm值值值值68-70C58-60C探针的Tm应该比引物Tm高10度58荧光基团的选择荧光基团的选择荧光基团的选择荧光基团的选择报告基团:报告基团: FAM, VIC, JOE, NED, CY3, CY5, Texas Red 依据不同仪器类型和不同光谱范围,选择不同染料淬灭基团:淬灭基团: TAMRA, MGB (无荧光)59TAMRATAMRA 作为淬灭基
9、团作为淬灭基团作为淬灭基团作为淬灭基团TAGCATTAAGGTCGAGCACTACGGTGACCATTAGATTAATCGGTCCAGCTCGTGATGCCACTGGTAATCTAATTTAMRAFAM两个缺点:1) TAMRA 染料具有荧光 ? 占据一个通道2) 探针趋向于长 (30-35 bp) ? 特异性小60NFQ: 非荧光淬灭基团MGB: 小沟结合物 (增加探针Tm值)小沟结合物小沟结合物小沟结合物小沟结合物NFQMGBRR: 报告染料TCCAGCTCGTGATGCT61MGBMGB如何工作如何工作如何工作如何工作? ?FAM-TCCAGCTCGTGATGCCAMGBTAGCATTA
10、AGGTCGAGCACTACGGTGACCATTAGATTAATCGGMGB提高探针Tm值, 可以使用较短探针? 提高探针与目标基因结合特异性62假设有两条相似的序列假设有两条相似的序列假设有两条相似的序列假设有两条相似的序列目的片段GTCCATACCAGGACAGGATAGATTAGACAGGATACCTCBlast 显示: 有一条类似的序列:GTCCATACCAGGCCAGGAGAGATTAGACAGGATACCTC63TAMRATAMRA 探针探针探针探针 (30(30- -40 40 碱基碱基碱基碱基) )目的片段:GTCCATACCAGGACAGGATAGATTAGACAGGATAC
11、CTCATGGTCCTGTCCTATCTAATCTGTCCTATG类似的序列: Tamra 探针可以结合GTCCATACCAGGCCAGGAGAGATTAGACAGGATACCTCATGGTCCTGTCCTATCTAATCTGTCCTATG64MGB MGB 探针探针探针探针(13(13- -18 18 碱基碱基碱基碱基) )目的片段:GTCCATACCAGGACAGGATAGATTAGACAGGATACCTCATGGTCCTGTCCTATCT-MGB类似的序列: MGB探针不结合GTCCATACCAGGCCAGGAGAGATTAGACAGGATACCTCATGGTCCTGTCCTATCT-M
12、GB65SYBRSYBR Green I Green I 染料染料染料染料66SYBRSYBR Green IGreen I染料染料染料染料67SYBRSYBR Green IGreen I染料染料染料染料68SYBRSYBR Green IGreen I染料染料染料染料69SYBRSYBR Green IGreen I染料问题染料问题染料问题染料问题结合非特异任何双链不准确结果非特异产物信号70通过溶解曲线检查特异性通过溶解曲线检查特异性通过溶解曲线检查特异性通过溶解曲线检查特异性温度?荧光?71溶解曲线溶解曲线溶解曲线溶解曲线: derivative view: derivative vi
13、ew只有一个的峰= 没 有多余的产物荧光?温度 ?72溶解曲线中的多余峰溶解曲线中的多余峰溶解曲线中的多余峰溶解曲线中的多余峰可能是引物二聚体73多余的峰是如何产生的多余的峰是如何产生的多余的峰是如何产生的多余的峰是如何产生的? ?非特异扩增 1、转录组中错误的目的基因。 2、引物结合在正确的序列,但是既检测基因组DNA又检测 cDNA(由于短的内含子,基因组DNA有较高的Tm值 )。 解决方法：设计引物时至少有一条跨过外显子的结 合点。解决方法：设计引物时至少有一条跨过外显子的结 合点。引物二聚体cDNA EXON 1EXON 2gDNAEXON 1EXON 2INTRON期望峰Tm高2峰7
14、4引物二聚体如何产生引物二聚体如何产生引物二聚体如何产生引物二聚体如何产生? ? 引物有太多的自身配对或者交叉配对引物和模板比率太高注意: 具有模板的样品有清晰的峰是正常的,但是阴性对 照有多余的峰。例如:正向引物:TGGTGAGTTCGATACGCTAT5反向引物:ATCTAGGCAATCCGTGAGAA 5GCACTCTTACCACTCA75引物浓度的筛选引物浓度的筛选引物浓度的筛选引物浓度的筛选50nM300nM900nM50nM300nM900nM正向引物反向引物SYBR?TaqMan7650nM300nM900nM50nM300nM900nM正向引物反向引物X XX XX X引物浓度
15、的筛选引物浓度的筛选引物浓度的筛选引物浓度的筛选77用最高敏感度的引物组合用最高敏感度的引物组合用最高敏感度的引物组合用最高敏感度的引物组合. . . . .50 / 50 nM300 / 300 nM900 / 900 nM78. . . . . . 同时也要避免形成引物二聚体同时也要避免形成引物二聚体同时也要避免形成引物二聚体同时也要避免形成引物二聚体对这组引物,所有的浓 度组合都只有一个峰79基线基线阈值线阈值线Ct 值值RnX axis +Cycles我们怎么获得结果我们怎么获得结果我们怎么获得结果我们怎么获得结果? ?Y axis首先让我们定义关于扩增曲线的各种概念首先让我们定义关于
16、扩增曲线的各种概念80基线基线阈值线阈值线Ct 值值RnCycles第一步：确定第一步：确定Ct值值我们怎么获得结果我们怎么获得结果我们怎么获得结果我们怎么获得结果? ?8181Log copy numberCt valuesCts01234567孔内包含4000个拷 贝目的基因我们怎么获得结果我们怎么获得结果我们怎么获得结果我们怎么获得结果? ?第二步：比较第二步：比较Ct值值82定量定量定量定量PCRPCR的应用的应用的应用的应用绝对定量绝对定量相对定量相对定量阴阳性鉴定阴阳性鉴定基因分型基因分型我们随后将对这些应用做进一步的了解我们随后将对这些应用做进一步的了解83Questions ?
