现代仪器分析论文

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1、淮 海 工 学 院课 程 设计报 告 书题 目： 现代仪器分析方法的应用研究东港学院 系（院）： 郁洲书院 专 业： 化学工程与工艺 班 级： D 化工 091 姓 名： 殷驰骏 学 号： 510930431 2010 年 12 月 1 日紫外紫外- -可见分光光度法在血清铜的测定中的应用可见分光光度法在血清铜的测定中的应用1 1 基本知识 紫外 可见光吸收光谱的本质 可见和紫外吸收光谱是在电磁波辐射的作用下，多原子分子的价电子发生跃 迁而产生的分子吸收光谱，它又称为电子光谱。 紫外 可见光的波长范围在 100 800nm ，根据能量的大小可分为三个区 域： 100 200nm ：远紫外 (

2、又名真空紫外 ) 区域， 200 400nm ；近紫外区域， 400 800nm ：可见区域 可见和紫外分光光度法，波长单位采用纳米表示，纳米现写作 nm(nanometer ，长度为 l0 -9 m ) ；或 m( 长度为 10 -7 cm ) 来表示， 两者长度相等。波长愈短，能量愈高。 2 2 分光光度计的一般结构 紫外 可见分光光度计是在比色计的基础上发展起来的。目前就其光路设 计来分 , 可分为单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长双光束分光光 度计三种。紫外和可见分光光度计基本结构由光源、单色器、样品室、检测器 及显示单元等几部分组成。 (1) 光源 紫外和可见分光光度计常用两

3、种光源：可见部分常用钨灯或碘钨灯，使用波 长范围 320nm 3.5m ，碘钨灯能量较大，寿命较长。紫外部分常用氢灯或 氘灯，使用波长范围在 160 300nm 左右。 近年来有的利用激光作为光源，由于方向性好，亮度高，单色性好，相干性 好大大提高了仪器的时间分辨率、波长分辨率和灵敏度。 (2) 单色器 单色器是仪器的主体，其作用是将光源来的光色散成各种波长的光，以供选 用。常用的有棱镜或光栅。玻璃棱镜仅适用于可见光区，天然水晶棱镜适用于 紫外光区。 棱镜产生色散的原理，是由于不同介质中折射率的变化，若石英棱镜的折射率 为 n ，入射角为 i ，进入空气中折射率为 n 0 ， 角度为 ( 图

4、-7) ，则有等式： = =n 即折射率的不同能将混合光色散成各种不同波长的光线。出光狭缝的单色器波 长，是棱镜转动变化的结果。 棱镜色散范围较广，波长可覆盖 185 2500nm ，而且 185300nm 的分 辨率优于光栅，但谱线排列均匀度较差，得不到均 的分辨率。在可见和近 红外区的色散和分辨率的误差更大于光栅。 光栅由 系列能够反射光线的平行小沟构成，根据衍射干涉原理，能够色 散成范围较广的不同波长光线符合等式： m=d ( sin i + sin ) 式中： i 入射角 衍射角 波长 d 小沟间距离 m 衍射级数 (0 ， 1 ， 2) 光栅分辨率好，且能保证波长的高度精确性，特别是

5、在可见区和近红外区要 优于棱镜，但次级谱线重叠，杂散光影响较大，需配用一系列分级滤光片。光 栅单色器的组成基本上与棱镜相同，也是由反射镜、光狭缝与光栅组成。 (3) 样品室 为避免杂散光，样品室需密闭，内涂黑色，比色杯的光程、形状、容量各不 相同，可根据样品情况加以选择。可见光用玻璃比色杯，紫外光用石英比色杯。(4) 检测器 检测器的作用是把光学信号转变为电信号，在分光光度计中常用硅光敏电池、 光电管和光电倍增管。硅光敏电池常用于可见和近红外光的检测，光电管只起 光电转换作用，没有放大的功能。在分光光度计中常用的是光电倍增管，它是 由光电管和高增益的放大器组成，以负高压 -200 -1000V

6、 调节阴极，并作 用于倍增电极 (Dynode) ，由光电阴极逸出的电子通过倍增电极的放大作用而 抵达阳极。可检测的波长在 200 900nm 之间，尤其对 200 600nm 波长 范围的检测灵敏度量高。3.3，5一diBrPADAP 自动化分析法测定血清铜铜是人体所必需的微量元素，为多种氧化酶的辅基，对维 持人体正常生理功能起重要作用，体内铜过多或过少都会导 致生理机能的紊乱1。目前，临床上多采用络合剂显色的手 工比色法 引，而应用自动生化分析仪测定血清铜的分析方法 则不多见。本文参考有关文献【4】，通过加速血清铜解离和使 蛋白稳定措施的研究，报道了以2一(3，5一二溴一2一吡啶偶 氮)一

7、5一二乙氨基酚(3，5一diBrPADAP)为显色剂，双试剂 两点终点法自动化测定血清铜的新方法。该法与5一Br一 脚自动分析法相比，灵敏度高、试剂空白小，准确、快速， 更值得临床推广应用。 1 材料与方法 I1 仪器与试剂 uv一2201紫外分光光度计(日本岛津)、 贝克曼CX一2O全自动生化分析仪、pH一3C酸度计(上海雷 磁分析仪器厂)。铜标准液；1570 tmolL。试剂一：含双氧 水、吐温一80、铜解离剂、pH 40乙酸一乙酸钠缓冲液。试剂 二：含3，5一diBrPADAP、曲拉通X一100、氟化钠。 12 方法贝克曼CX一20测定参数：标准液浓度15，70，样 品样30 I，测定方

8、法两点终点法，副(主)波长700 am570 hill， 测定点(16)(31)，试剂-200 tA，试剂-50“I。计算：血清铜浓 度(tmolL)=AI， 1570 2 结果 2，1 标准曲线按本法测定，Cu2 含量在(080)tmolL 范 围内线性良好，回归方程和相关系数分别为A=6，2810 +0001，r=09997，其表观摩尔吸收系数为598 10 L mol一 em 。 22 回收试验 取已测得Cu2 含量为1422 molL的混合 血清标本分别加入715、1530、2245molL 铜()标准液 进行回收试验。回收率分别为987 、993 、1025 ，平均 回收率为100。

9、2 。 23 精密度将一份混合血清分为12份，按本法测定，测得 血清铜平均值为1675molL，批内变异系数(cv)为0018。 另取一混合血清连续测定6天，每天平行两次，测得血清铜平 均值为1533 tmolL，批问CV 为0023。 24 方法对比试验用本法和原子吸收法 】分别测定20例 血清标本，本法(Y)测得的平均值为1493 molL，原子吸收 法(x)测得的平均值为1498molL，两种方法有很好的相关 性，回归方程为Y=09952X+00269，r：09983，经t检 验，两者差异无显著意义(P005)。 65“molL 不干扰，血清中其他常量和微量元素10倍量不干 扰。 2，6

10、 正常参考值选择89名体检合格成年人，男48名，女 41名。年龄1958岁。空腹静脉采血，用本法测得血清铜含量(js)为(1668260)landL。参考范围(互2s)；1148 2188“molA_。与文献报道2-4】基本一致。 3 讨论 31 波长选择按本法对标准管、测定管进行显色，在uV一 2201紫外可见分光光度计上扫描，测得标准管、测定管二者络 合物最大吸收波长均在572 nnl处，因为绝大多数的生化自动 分析仪无此波长，因此选用靠近572 Ilnl的570 Ilnl作为测定的 主波长。 3，2 酸度选择 3，5一diBrPADAP 与Cu2 在pH 30 100范围内形成稳定络合物

11、，吸光度最大且恒定。由于在pH 9左右3，5一diBrPADAP 除能与Cu2 显色外，而且能与 Fe3 、Znn 、pb3 等发生灵敏的显色反应；而在pH40左右显 色时，血清中仅Fe3 干扰测定(可通过加入一定量的氟化钠 得以消除)，且血清铜在pH40-lgeNaAc缓冲溶液中的解 离速度明显快于在pH9，0的缓冲介质，因此选择pH40的酸 度较为合适。 33 表面活性剂的选择试验了溴化十六烷基砒啶(CPB)、 溴化十六烷基三甲铵(CTMAB)、聚氧乙烯异辛基苯基醚 (TritonX100)、聚乙二醇辛基苯基醚(OP)、十二烷基磺酸钠 (SDS)、Brij一35、Tween一20、Twee

12、n一80等表面活性剂对3，5 一BrPADAPCu 配合物的增敏、增溶作用，发现在pH40 测定体系中阳离子型、阴离子型表面活性剂会使体系出现浑 浊，非离子表面活性剂能使体系保持清亮、透明且起明显的增 溶、增敏、增稳作用。经过筛选，以Tween一80，TiltonX 一100 混合表面活性剂效果最佳。 34 3，5一diBrPADAP法 目前文献报道的血清铜测定方 法很多，但由于受反应时间限制，大多为手工测定法；我们以 3，5一diBr一 显色剂，建立了双试剂自动化测定血清铜 的新方法，该法与5一BrPADAP 自动分析法相比，测定灵敏 度高，试剂空白小，简单、快速，更适合临床应用。操作中应防

13、 止其它离子的污染，尤其是在用双缩脲试剂测定总蛋白之后， 管道中常粘附有高浓度的Cu2 ，易对测定引起正干扰，需加 以避免。4.技术展望和应用前景技术展望和应用前景近十年来，紫外/可见分光技术变化不大，始终没有革命性的突破。然而，随着 光学设计、电子技术和软件的进步，使得仪器的复杂性降低，可靠性和分析效 能提高，这些都说明传统仪器也在不断发展。高端系统如紫外/可见/近红外仪器 采用了多个检测器，可对大体积样品、固体样品进行分析，可快速扫描，配有 多个探头和其他附件。对于传统仪器而言，光学设计上最具革命性的进展也许是 1998 年 Varian 公司 推出的 Cary 50，即第一个应用了闪光氙

14、灯的紫外/可见分光光度计，可对反应 进行监控，而在此之前，只有 PDA 系统可以做到这一点。然而，PDA 系统现在变得越来越流行，并且随着 CCD 的应用日益广泛，如用 于条形码扫描器、传真机、复印机和数码相机等产量巨大的商品，其价格也在 急剧下滑。工作在紫外/可见波段范围的微型光纤分光系统的出现，扩展了紫外/可见分光技 术的应用范围，尤其使在苛刻的环境条件下进行分析工作成为可能。尽管目前 还没有采用这项技术的紫外/可见分光仪器的销售数据，但 Ocean Optics 已卖 出了超过 50，000 套低端系统用于近红外、紫外、紫外/可见和拉曼等光谱仪器。AstraNet Systems Ltd

15、（剑桥，英格兰）将二极管阵列与光纤探头集成在一起， 实现了对沸腾液体的原位测试和在线反应监测，并且其分析浓度较之传统仪器 提高了 1000 倍。这一领域的另一项创新技术是高分辨数字成像，譬如来自 CRAIC Technologies（阿尔塔迪纳，加利福尼亚州）的 QDI 2000 显微分光光度计， 该仪器包括一个可制冷 CCD 阵列检测器，可在几毫秒内对微观样品进行测试， 并且噪音极低。当前，集成化已成为许多商品化仪器的基本要素，譬如通过集成条形码阅 读器和参比光束技术，从而提供一个完整的用户解决方案。一个很好的例子就 是在药物溶出领域，一些药物溶出测试仪器的供货商已开始与光谱仪器的供货 商进行合作，进而拓展双方的市场。离我们最近的一次成功合作案例的协议签 署双方是 Sotax AG（巴塞尔，瑞士）和 Thermo Electron Corp（沃尔瑟姆， 马萨诸塞州）。在分析化学和质量控制方面，传统的紫外/可见分光光度计有着悠久的应用历史， 其应用范围是极其广泛的，毫无疑问，随着技术的发展，作为一项实验室基础 的分析技术，将会有新的用途被发现，特别是在制药和生物技术方面。然而，现在我们能够清晰看到的是：在紫外/可见范围内的低