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1、植物组织培养过程植物组织培养过程一、原理 植物组织经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。早在 1957 年 Skoog 即发现培养基中植物激素的类型和它们的比例，对再分化过程起着重要的作用。 二、试剂与仪器设备 （一）试剂 ? 乙醇。 ? IAA 或 2 ， 4 D 。 ? HgCl 2 （或次氯酸钠） 。 ? 6- 苄基氨基腺嘌呤（ 6-BA ） ? MS 培养基（见附录） 。 （二）仪器设备 培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖刀，三角烧瓶（ 100mL ） ，烧杯，量筒，培养皿，棉线，接种箱或超净工作台，分析天平，长镊子，
2、剪刀，容量瓶，移液管，牛皮纸。 三、实验步骤 1. 配制培养基 （ 1 ）愈伤组织诱导培养基： MS 培养基（蔗糖含量为 10 g/L ， 2,4 D 含量为 2 mg/L ，琼脂 10 g/L ） 。 （ 2 ）试验培养基：在 MS 培养基中按表 33 1 加入 IAA 和 6BA 。 吲哚乙酸先用少量 0.1 mol/L NaOH 溶解， 6- 苄基氨基腺嘌呤先用少量 0.1 mol/L HCl 溶解，然后用蒸馏水稀释，再加入培养基中。 表 33 1 试验培养基中 IAA 和 6 BA 含量 序号 IAA （ mg/L ） 6-BA （ mg/L ） 相对比值 1 0 2.0 2 0.2
3、2.0 1:10 3 0.5 2.0 1:4 4 1.0 2.0 1:2 5 2.0 2.0 1:1 6 2.0 1.0 2:1 7 2.0 0.5 4:1 8 2.0 0.2 10:1 9 2.0 0 2. 培养基灭菌 将配好的培养基加入琼脂加热溶解，调至 pH 5.8 ，趁热分装于 100 mL 三角烧瓶中，每瓶约 20 mL 。待培养基冷却凝固后，用一层称量纸和一层牛皮纸包扎瓶（管）口，并用棉线扎牢，然后在高压灭菌锅中 121 （ 1 kg/cm 2 ）下灭菌 20 min 。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（如长镊子、解剖刀、剪刀等）及灭菌水，需同时灭菌。 3
4、. 诱导产生愈伤组织 （ 1 ）取健壮的烟草茎数段，每段约 5 cm 长，于烧杯中用 0.1% 氯化汞（升汞）浸泡 20 min ，取出用无菌水洗 3 4 次，置于无菌培养皿中，在接种箱中按无菌操作要求剥去外皮（接种箱事先用紫外灯灭菌 30 min ） ，用解剖刀切成 5 mm 厚的圆片（弃去开始一片和最后一片） ，用长镊子将它接种在诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶接种 4 片，接种后扎好瓶口。 （ 2 ）将已接入植物组织（外植体）的三角烧瓶，培养在 25 温室中，每星期检查 l 2 次，剔除材料已被杂菌污染的三角烧瓶， 3 4 周后产生愈伤组织。 （ 3 ）选取愈伤组织生长良好的
5、三角烧瓶，用解剖刀将愈伤组织切下，转移到含有不同激素的试验培养基中（也可以连同原来的外植体一起转移） ，每瓶放 1 2 块，仍培养在 25 温室中，每周 1 2 次观察不同处理的三角烧瓶中，愈伤组织分化情况，直至长出根和芽。长成的幼小植株即为“试管苗” ，可移栽于花盆中。植物组织培养发展简史植物组织培养是 20 世纪 30 年代初期发展起来的一项生物技术。它是在人工配制的培养基上，于无菌状态下培养植物器官、组织、细胞、原生质体等材料的方法。植物细胞的全能性是植物组织培养的理论基础。20 世纪初，曾有人提出能否将植物的薄壁细胞培养成完整植株?研究者从胡萝卜根的韧皮部取下一块组织，并在液体培养基中
6、培养，使其分化出了愈伤组织，从愈伤组织又得到胚状体，胚状体转移到固体培养基上继续培养后，获得了完整的胡萝卜试管植株。经过栽培，此植株能够正常生长并开花结果，其种子繁衍出来的后代与正常植株的种子所繁衍出的后代别无二致。根据此实验可以得出以下结论：即不经过有性生殖过程也能将植物的薄壁细胞培养出与母体一样的完整植株。由于植物的每个有核细胞都携带着母体的全部基因，故在一定条件下，它们均能发育成完整植株，这就是所谓的植物细胞全能性。科学家在植物激素对器官建成，及改进培养基配方等方面所取得的成果，极大地推动了组织培养技术的发展，使这项技术可以实际应用于快速繁殖、品种改良等方面。20 世纪 50 年代初期，
7、法国科学家利用组织培养技术成功地脱除了染病大丽花植株所携带的病毒，从而为脱毒苗的生产提供了一种可行的途径。现在凭借组织培养技术来脱除植物的病毒已经在生产中广泛应用。20 世纪 50 年代中期，由于细胞分裂素的发现，使组织培养状态下外植体芽的形态建成成为可人为调控的因素，从而使在组织培养状况下进行植株再生成为现实。进入 60 年代以后，组织培养技术在基础理论、实际操作方面不断取得进展，相继在植物体细胞杂交、单倍体育种、种质资源保存、快速育苗、人工种子制造、次生代谢物生产等方面有了可喜的成果。时至今日，组织培养技术已经成为基础坚实、易于掌握、应用面广的一种技术手段。愈伤组织及其形成 愈伤组织（ca
8、llus）原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木与接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木和接穗沟通；在扦插中，从伤口愈伤组织可分化出不定根或不定芽，进而形成完整植株。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。其发生过程是：外植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。从植物器官、组织、细胞离体培养所产生的愈伤组织，在一定条件下可进一步诱导器官再生或胚状体而形成植株。在单倍体育种
9、中，也可由花粉产生的愈伤组织或胚状体分化成单倍体植株。甚至可由原生质体培养诱导植株或器官再生。故愈伤组织的概念已不局限于植物体创伤部分的新生组织了。在植物的组织培养中，从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：启动期、分裂期和形成期。启动期指细胞准备进行分裂的时期。外源植物生长激素对诱导细胞开始分裂效果很好。常用的有萘乙酸、吲哚乙酸、细胞分裂素等。通常使用细胞分裂素和生长素比例在 11 来诱导植物材料愈伤组织的形成，如 MS+6-BA6-BA 是一种人工合成的细胞分裂素 6基腺嘌呤的简称。0.5 mg/L+IBAIBA 是一种人工合成的生长素吲哚丁酸的简称。0.5 mg/L。分裂期是
10、指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。分裂期愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。分化期是指在分裂的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞等等。外植体的细胞经过启动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（24 个星期）将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。愈伤组织的形态发生方式经过启动、分裂和分化期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化，但并没有器官发生。只有满足某些条件，愈伤组织的细胞才会发生再分化，产生芽和根，进而发育成完整植株。组织培养中诱导丛芽产生一般使用较高的细胞分裂素和较低的生长素配比，如 MS+6-BA1 mg/L+IAA（IAA 是一种生长素3-吲哚乙酸的简称。 ）0.1 mg/L。而诱导生根时则可采用1/2MS+IAA0.1 mg/L 等。当然，不同的植物种类、不同的生长状态，激素的配比
