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1、生化实验五大技术生化实验五大技术1.分光光度技术分光光度技术1.定义：定义：根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收，每种物质都具有其特异根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收，每种物质都具有其特异的吸收光谱，而建立起来的一种定量、定性分析的技术。的吸收光谱，而建立起来的一种定量、定性分析的技术。2.基本原理：基本原理：透光度透光度 T=It / Io吸光度吸光度 A=lg(Io/ It)朗伯朗伯-比尔比尔(1ambert-Beer)定律定律 :AKLc【K 为吸光率，为吸光率，L 为溶液厚度（为溶液厚度（cm） ，c 为溶液浓为溶液浓度度（mol/L） 】摩尔吸光系数摩尔吸光系数 ：1 摩尔浓
2、度的溶液在厚度为摩尔浓度的溶液在厚度为 1cm 时，在某一特定波长下时，在某一特定波长下 的吸光度。的吸光度。 c=A/3.定量分析：定量分析：（1）标准曲线）标准曲线(工作曲线工作曲线)法法 （2）对比法）对比法 （3）计算法：）计算法： c=A/ （4）差示分析法（适用于浓度过浓或过稀）差示分析法（适用于浓度过浓或过稀） （5）多组分混合物测定）多组分混合物测定4.技术分类技术分类分子吸收法分子吸收法不要将比色杯放在分光光度计上；试验完成后，关闭电源，洗净比色皿。6纸层析法观察转氨基作用纸层析法观察转氨基作用1.实验原理：实验原理：氨基酸的转氨基作用实验组发生转氨基反应，最后体系中有两种氨
3、基酸；对照组不发生转氨基反应，体系中只有一种氨基酸；纸层析法（分配层析）：滤纸支持物 固定相水 流动相乙醇（有机溶剂）由于混合物中的各成分的分配系数不同，分离受固定相的阻力和受流动相的推力影响不同，各组分移动速度不同，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附和交换作用，最终结果是使混合物得到分离。在固定相中分配趋势较大的组分，随流动相移动的速率较慢，不同组分在纸上移动的速率不同，用 Rf 表示：Rf=溶质中心到原点中心的距离溶质中心到原点中心的距离/溶剂前缘到原点中心的距离溶剂前缘到原点中心的距离待测血清样本-1.0 氯化钠溶液1.0 0.80.60.40.2- 双锁脲试剂4.0 4
4、.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 光吸收值00.0850.1810.2610.3540.4380.317物质在一定的溶剂中的分配系数是一定的，故比移值 Rf 可用来鉴别被分离的物质。2.实验操作：实验操作：肝匀浆的制备肝匀浆的制备转氨基反应：转氨基反应：取干净试管 2 支，分别标明测定管与对照管，按下表操作点样点样（注意点样斑点不可太大，直径应小于 0.5cm）层析：层析：在滤纸圆心处打一小孔，另取同类滤纸卷成圆筒如灯芯插入小孔；将滤纸放在培养皿上，灯芯下端浸入层析液中, 待溶剂前沿距滤纸边缘约 1/3 处，取出滤纸。显色显色/染色：染色：将上述滤纸平放在培养皿上，用喷雾器向滤纸均
5、匀喷射 0.1%茚三酮溶液，再用烘烤机烘干，此时可见紫红色斑点出现，用铅笔圈下各显色点。分析结果：分析结果：比较色斑的位置及色泽深浅，用铅笔描出色斑轮廓,并按下表记录有关数据,分别计算丙氨酸和谷氨酸的 Rf 值及样品中氨基酸的 Rf 值，分析是否发生了转氨基反应。3.实验讨论与注意事项：实验讨论与注意事项：1、从表格（1）中可以看出，测定管上清液点样出现了两个色斑，根据 Rf 值的计算也可以看出，测定管中氨基酸发生了转氨基作用，生成的未知物质 b 为谷氨酸，则未知溶质a 为丙氨酸；对照管中因为酶的失活而没有发生转氨基反应，只有丙氨酸，所以色斑只有一个。试剂（试剂（d） 测定管测定管 对照管对照
6、管 肝匀浆肝匀浆 10 1037水浴水浴 10min 沸水浴沸水浴 10min 丙氨酸丙氨酸 10 10 -酮戊二酸酮戊二酸 10 102、层析点样时手要洗净，操作中尽可能少量接触滤纸，以免污染。3、点样点不宜过大，直径小于 0.5cm.7血糖的测定（葡萄糖氧化酶法）血糖的测定（葡萄糖氧化酶法）1.实验原理：实验原理：葡萄糖氧化酶 (GOD) 能将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢。后者在过氧化物酶 (POD)作用下，分解为水和氧的同时将无色的 4-氨基安替比林与酚氧化缩合生成红色的醌类化合物，其颜色的深浅在一定范围内与葡萄糖浓度成正比，在 500nm 波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血糖的浓度Ps:Ps:该方法特异性高，反应条件温和，能反映血中葡萄糖的真实含量该方法特异性高，反应条件温和，能反映血中葡萄糖的真实含量2.实验操作：实验操作：取 3 支试管,编号，按下表操作。 混匀，置 37 水浴中保温 15 分钟，在波长 505nm 处比色，以空白管调零，读取 标准管及测定管吸光度。 【计算计算】血清葡萄糖(mmol/L) =( 测定管吸光度/标准管吸光度) 5.55【正常参考范围正常参考范围】 3.96.1mmol/L加入物 (ml)空白管标准管测定管 血清0. 2 葡萄糖标准液0. 2 蒸馏水0. 2 酶酚混合液2.02.02.0
