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1、生物化学实验指导实验一 蛋白质性质实验【实验目的】加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。【实验原理】1.蛋白质的沉淀反应蛋白质分子由于形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的、相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷、脱水，甚至变性而丧失稳定因素，即以固态形式从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的沉淀反应。该反应可分为以下两种类型：（1）可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但其分子内部结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质。沉淀因素除去后，蛋白质沉淀可再溶于原来的溶剂中。这种沉淀反
2、应为可逆沉淀反应。属于此类反应的有盐析作用；在低温下，乙醇或丙酮对蛋白质的短时间作用以及等电点沉淀等。用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。沉淀出的蛋白质仍保持其天然蛋白质的性质，若减低盐的浓度时，还能溶解。（2）不可逆的沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质的分子内部结构，空间构象遭到破坏，失去其天然蛋白质的性质，这时蛋白质已发生变性。变性后的蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶液中，这种沉淀反应称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、强酸、
3、强碱、加热、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。【实验试剂和器材】（一）试剂1. 鸡蛋清2. 95%乙醇3. 三氯乙酸4. 饱和硫酸铵5固体硫酸铵（二）器材试管及试管架，电炉，玻璃漏斗，滤纸，移液管，滴管。【实验步骤】1盐析沉淀：取蛋清约 2ml 于试管中，加入等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，观察现象。若有沉淀析出，则为卵球蛋白，静置数分钟，用滤纸过滤，滤出的沉淀物质重新放入蒸馏水中，观察现象。将滤液放于试管中，再加入固体硫酸铵使达到饱和，观察现象。2有机溶剂沉淀：将盐析所得到的蛋白质重新溶于数毫升水中，摇匀使其溶解。向溶液中加入 95%乙醇数滴，强力摇匀，观察结果。3加热沉淀
4、：将盐析所得到的蛋白质重新溶于数毫升水中，摇匀使其溶解。将试管置于沸水浴中加热并观察现象。4变性剂沉淀：将盐析所得到的蛋白质重新溶于数毫升水中，摇匀使其溶解。在试管中滴入数滴三氯乙酸，观察现象。【实验结果】列表写出各步骤的实验现象及原因实验二 考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量【实验目的】蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G-250 法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性
5、好，是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250 在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在 595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm 处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和考马
6、斯亮蓝 G-250 结合，在 2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下 1 小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。【实验试剂和器材】1.仪器电子天平、试管、试管架、移液管、容量瓶、721 型分光光度剂2.试剂 （1）标准蛋白质溶液：称取 10mg 牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至 100mL，制成100g/mL牛血清白蛋白溶液（2）考马斯亮蓝 G-250 蛋白试剂：称取 100mg 考马斯亮蓝 G-250，溶于 50mL90%乙醇中，加入 85%的磷酸 100mL，最后用蒸馏水定容到 1000mL
7、。（3）2g 绿豆芽研磨后的提取液定容至 50mL【实验步骤】1、标准曲线绘制取 6 支试管，按下表加入各试剂。管号试剂 0 1 2 3 4 5100g/mL牛血清白蛋白溶液 mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸馏水mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0考马斯亮蓝液mL 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0蛋白质含量/g 0 20 40 60 80 100加入考马斯亮蓝 G-250 蛋白试剂后，摇匀，放置 2min 后，在 595nm 波长下比色测定，记录 A595。以各管相应标准蛋白质含量（ mg）为横坐标、 A595 为纵坐标，绘制标准曲线。2、样品测定试
8、管中加自制蛋白质样品 1.0mL ，再加入 5.0mL 考马斯亮蓝 G-250 试剂，摇匀，放置 5min 后，在 595nm 波长下比色，记录 A595。根据所测 A595 从标准曲线上查得蛋白质含量。【实验结果】根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（g） ，按下式计算：查得的蛋白质含量（g）提取液总体积（mL ）样品蛋白质含量（g/g 鲜重） =样品鲜重（g）测定时取用的提取液体积（mL）【注意事项】（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的 520min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。比色反应需在 1h 内完成。（2）测定中，蛋白-染料复合物会有
9、少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。实验三 糖的性质实验及总糖和还原糖含量测定【实验目的】1.加深对单糖、二糖、多糖化学性质的认识，进一步体会糖类化合物的分子结构与其化学性质的关系。2. 掌握 3，5二硝基水杨酸法测定还原糖的基本原理。【实验原理】糖是多羟基醛、多羟基酮或它们的缩合物。单糖及分子中含有半缩醛（酮）羟基的二糖都具有还原性，能将 Fehling 试剂还原成砖红色的 Cu2O 沉淀。蔗糖等不含有半缩醛（酮）羟基的糖则无还原性。但蔗糖经水解生成了葡萄糖和果糖，因而水解液具有还原性。多糖是由许多单糖缩合而成的高分子化合物，无
10、还原性。但多糖在酸存在下加热水解，可生成单糖，随之具有还原性。淀粉为一多糖，经水解先生成糊精，再水解成麦芽糖，最终水解产物是葡萄糖，因此水解液也具有还原性，能与 Fehling 试剂发生反应。淀粉遇碘显蓝色，此反应很灵敏，常用于检验淀粉或碘。还原糖在碱性条件下，可变成非常活泼的烯二醇。遇氧化剂时，具有还原能力，烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物。黄色的 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的 3-氨基-5- 硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比，在波长为 540nm 处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中
11、还原糖的含量。对于非还原性的双糖（如蔗糖）以及还原性很小的多糖（如淀粉） ，应先用酸水解法将它们彻底水解成单糖。再借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。【实验试剂和器材】1.材料面粉2.仪器分光光度计 电子天平 沸水浴3.器材试管、容 量 瓶、锥 形 瓶、移 液 管、烧杯、滴管、洗耳球、漏斗、洗瓶、试管夹4. 3，5二硝基水杨酸试剂(DNS)：6.3gDNS 和 262mL2mol/LNaOH 加入到 500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加入 5g 重蒸酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容至 1000mL，贮存于棕色瓶中。5. 葡萄糖标准溶液(1mg/mL)：准
12、确称取干燥恒重的葡萄糖 100mg，加入少量水溶解后再加以蒸馏水定容至 100mL。【实验步骤】COHOHNO2O2N- COHOHO2N NH23,5- 3-5-CCHOOHOHCHCH2OHOH( )n ( )nCHCOHOHCHCH2OHOH （一）糖的还原性：取 5 支大试管，编号后各加入 1ml Fehling 试剂，再分别加入 2%葡萄糖、2%果糖、2%麦芽糖、2%蔗糖和 2%淀粉溶液各 10 滴。振荡后，将试管用橡皮筋捆好放入沸水浴中，加热 35 分钟，观察那几个试管中生成砖红色沉淀。（二）蔗糖的水解：取 2 支大试管，各加入 2%蔗糖溶液 1ml，然后于一支试管中加入3molL
13、-1H2SO4 2 滴，将此支试管置于沸水浴中加热 510 分钟，冷却后，用 10%Na2CO3中和，直到没有气泡发生为止。将两支试管各加入 Fehling 试剂 1ml，再在沸水浴中加热35 分钟，观察并比较两管的_结果。（三）淀粉与碘的作用：取 1 支大试管加 10 滴 2%淀粉溶液和 1 滴 0.1%碘液，观察呈现的颜色。然后将此试管放入沸水浴中加热 510 分钟，观察有何现象。（四）淀粉的水解：取 1 支大试管，加 2%淀粉溶液 2mL，再加入浓盐酸 3 滴，在沸水浴中加热 1015 分钟，加热时每隔 12 分钟取出 1 滴反应液，置于白瓷滴板上，加 1 滴碘液，注意观察其颜色的变化过
14、程，直到无蓝色出现为止。取出试管，冷却后，用 10%Na2CO3中和，直到没有气泡发生为止，加入 Fehling 试剂 510 滴，然后在沸水浴中加热 35 分钟，观察结果。（五）样品中还原糖的提取称取面粉 3.0g 放入 100mL 三角瓶中，先加入少量水调成糊状，再加 50mL 左右水摇匀，置于 50恒温水浴中保温 20min，使还原糖浸出，离心或过滤，用 20mL 蒸馏水洗残渣，离心或过滤，将两次上清液全部收集在 100mL 的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。（六）样品中总糖的提取(1) 取材：称取 1g 面粉，准确记录实际质量（W） ，放入 100mL 锥形瓶中。
15、(2) 溶解：先用几滴蒸馏水调成糊状；加入 15mL 蒸馏水；再加入 10mL 6N HCl，搅匀。(3) 水解：置于沸水浴中水解 30 分钟。用玻璃棒取一滴水解液于白瓷板中，加 1 滴碘液，检查淀粉水解程度。如显蓝色，表明未水解完全，应继续水解。如已水解完全，则不显蓝色，可以取出沸水浴中的锥形瓶，冷却。(4) 中和：加 1 滴酚酞指示剂，加入 10mL 6N NaOH 中和至微红色。(5) 定容：将溶液转移至 100mL 容量瓶（B 1）中，定容。(6) 过滤：用滤纸过滤。 （注意，滤纸不能用蒸馏水湿润。 ）(7) 稀释：精确吸取滤液 10mL，移入另一个 100mL 容量瓶（B 2）中，定
16、容。 （B 2）液作为总糖待测液备用。（七） 标准曲线制作及样品测定取 8 支试管，按下表所示顺序操作。空白 标准葡萄糖浓度梯度 样品管号操作 0 1 2 3 4 5 还原糖 总糖葡萄糖标准液(mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0样品待测液(mL) 2.0 1.0蒸馏水(mL) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0 1.0DNS 试剂 (mL) 各 2.0反应 各管混匀，沸水浴 5 分钟比色 以 0 号管为空白参比，测定=540nm 处的吸光度记录吸光度（A 540）将各管摇匀，在沸水浴中加热 5min，取出后立即冷却至室温，再以蒸馏水定容至25mL，混匀。在 540nm 波长下，用 0 号管调零，分别读取 1-5 号管的吸光度。由 0
