α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法

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1、2.2 实验方法2.2.1-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法2.2.1.1 反应溶液的制备(1)配制底物 PNPG 溶液:精确称取 0.3766gPNPG,加适量 0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH 为 6.8)溶解,再用容量瓶准确定容到 50mL,配制成 25mmol/L 的母液。将母液分别稀释成 0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L7 个不同梯度的标准品溶液,备用。(2)配制 -葡萄糖苷酶的酶溶液:将冻干酶粉(酶活力为 14u/mg)用 0.01mol/L磷酸缓冲液(pH 为 6.8)溶解,配制成 2u/mL 的母液。再将酶液分别稀释,配制成0.1、0.2、0.3

2、、0.4、0.5、1.0u/mL 的酶溶液,备用。(3)配制 DNJ 标准溶液(抑制剂):精确称取 0.0010g DNJ 标准品,用容量瓶准确定容到 10mL,配制成 1000g/mL DNJ 标准母液。将母液分别稀释成、1、5、10、20、40、60g/mL 六个不同梯度的标准品溶液,备用。(6)0.2mol/L 的 Na2CO3:称取 2.16g Na2CO3于烧杯中,加入适量蒸馏水溶解,并定容到 100mL,4下保存,备用。2.2.1.2 PNP 标准曲线的绘制精确称取0.0278g对硝基酚(PNP) ,加0.01mol/L磷酸缓冲液(pH为6.8)溶解,再用容量瓶定容至10mL,即得

3、20mmol/L母液。用蒸馏水将其母液稀释成浓度分别为1、5、10、20、40、40、80和100mol/L的标准溶液。取100l上述标准液,各加入150L 0.2mol/L的Na2CO3,混匀 1 min ,再于405 nm处测定其吸光度,得标准曲线方程:y=128.13x+0.3579 (R2 =0.9998),其中y 为浓度,x为吸光值。 2.2.1.3 -葡萄糖苷酶抑制活性的测定测定方法参照 Masao Hattori 等试验条件,并做调整。实验分为空白组、对照组、样品空白组和样品组,各反应物按表中剂量在 96 孔板中进行加样,每组 3 个平行。按表依次加入 PBS 缓冲液、抑制剂溶液

4、和底物,混合均匀,于 37水浴保温 10min,结束后,取出,加入 37水浴的酶溶液,充分混匀,于 37水浴反应 20min,结束后加入 150L 0.2mol/L 的 Na2CO3溶液中止反应。由于 PNPG 在 -葡萄糖苷酶的作用下能水解产生葡萄糖和 PNP,PNP 在 405nm 处有最大吸收,其测定其吸光度,根据公式便可计算出各样品 -葡萄糖苷酶的抑制率及 IC50值。 2公式 %100AAAAAA% BCSBSBC抑制率表 4 各反应物添加计量和顺序 (单位:L)Table 4 The respective reactants add measurement and sequence

5、 ( Unit: L )试剂空白组对照组样品空白组样品组PBS 溶液80706050 抑制剂002020 PNPG 底物20202020 充分混匀,37下孵化 10min 酶溶液010010 充分混匀,37下反应 20min 碳酸钠1501501501502.2.2 单因素试验设计以底物浓度、酶浓度、酶促反应时间和添加顺序为考察因素,以 DNJ 的 -葡萄糖苷酶抑制率为衡量指标,进行单因素试验。固定反应顺序为抑制剂+酶再加底物、底物浓度为 2.0mmol/L,酶浓度 0.3u/mL,缓冲液 pH 为 6.80,反应时间为 20min。2.2.2.1 反应物添加顺序分别考察如下三种不同的反应顺序

6、对抑制活性的影响。a、抑制剂+底物37温育 10min+酶,反应 20min碳酸钠终止反应测定b、抑制剂+酶37温育 10min+底物,反应 20min碳酸钠终止反应测定c、底物+酶37温育 10min+抑制剂,反应 20min碳酸钠终止反应测定2.2.2.2 底物浓度选 DNJ 和拜唐苹为抑制剂,以其 -葡萄糖苷酶抑制率为指标,考察0.5、1.0、2.0、4.0、5.0mmol/L 这 5 个不同梯度的底物对抑制活性的影响。2.2.2.3 酶浓度选 DNJ 和拜唐苹为抑制剂,以其 -葡萄糖苷酶抑制率为指标,考察0.1、0.3、0.5、0.7、0.9u/mL5 个不同浓度的酶对抑制活性的影响。

7、2.2.2.4 缓冲液 pH选 DNJ 和拜唐苹为抑制剂,以其 -葡萄糖苷酶抑制率为指标,分别考察不同pH6.6、6.8、7.0、7.2 和 7.4 的缓冲液对抑制活性的影响。2.2.2.5 反应时间选 DNJ 和拜唐苹为抑制剂,以其 -葡萄糖苷酶抑制率为指标,考察310、20、30、40 和 50min 不同反应时间对抑制活性的影响。参考文献参考文献1Ma C M, Hattori M, Daneshtalab M, et al. Chlorogenic acid derivatives with alkyl chains of different lengths and orientations: potent alpha-glucosidase inhibitorsJ. J Med Chem, 2008,51(19):6188-6194.

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