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1、河北医科大学硕士学位论文C-erbB2反义寡核苷酸诱导卵巢癌细胞凋亡姓名：任秀聪申请学位级别：硕士专业：妇产科学指导教师：宋俊芬;康山2003.3.1中文摘要C - e r b B 2 反义寡核督酸诱导卵巢癌细胞凋亡攘要霹熊；卵巢癌楚妇秘常见恶性肿瘤，在现有手术、放疗、诧疗滚疗手段下，努巢癌5 年望存率童簿德在2 8 镪3 5 ，放有必要寻找凝熬治疗方法，以进一步提凑卵巢癌患者的生存时间。卵巢瘸和其它恶健肿瘸一榉是涉及多基因改变的疾病。西就，基因治疗露惑楚其根本的治疗途径。许多研究表唆，癌纂函覆撺癌基因鼢过度表达对弗巢癌鳃生物学行为及籁薅蠢影璃。毽翦丈郝分实验搽辩袭踺缀癌基因C e r b B
2、 2 在大约2 0 9 4 0 的卵巢癌中存在基因扩增和其缀自产物的过度表达。宥作者对卵巢癌细胞株进行研究，发现C - e r b B 2 过度袭：送暂侵袭力强，恶性程度禽，说臻C e r b B 2 袭达与窝巢瘗的生物学行为旃一定关系。F l i p 等研究C - e r b B 2 的进度袭达与舞巢癌颈后敷仡疗的关系，结巢显示：晚期瓣癀、手术蠢残余瘗及慰纯疗不敏感者，C - e r b B 2 表达率琏，裔统计学意义。显C - e r b B 2阳性袭预聪盟盈不良。B e r c h u c k 等及M a s o o d 也发现，e- e r b B 2 过度表达者颡后不良。提示C e
3、r b B 2 与卵巢癌的颈后璧负稻关。由予C - e r b B 2 潦癌基因在卵巢癌中主要戳扩瀵翻嵩表达形式存在，在理论上，应耀C e r b B 2 反义核酸窍霹戆封阙冀癌基因鼢凄表达，从褥搀枣l 瓣瘗纲魏增殖选到漉疗跫的。本实验利用C - e r b B 2 反义寡核管酸佟磁予入舞巢癌缀施株S K O V 3 ，体羚躐察其对辩巢璃缀飚增穗、凋亡鞠C - e r b B 2 癌基因表达产物艇影嫡，初步撵导中文摘要C - e r b B 2 反义寡核苷酸抗肿瘤机制，为卵巢癌的的治疗提供新的思路。方法：1 反义寡核苷酸的设计设计顺序互补于人的C e r b B 2m R N A5 端起始编码
4、区的1 5 个碱基序列的反义寡核苷酸，并合成相应的正义寡核苷酸作对照，反义和正义寡核苷酸均经硫代磷酸化修饰。2 细胞培养将处于指数生长期的卵巢癌S K O V 3 细胞以5 1 0 个m l 浓度加入2 4 孔培养板中，每孔加1 M 。培养2 4 小时，细胞贴壁后分反义组、正义组和空自组三组，分别往每组中加入等量5 删o l L 的反义、正义寡核苷酸和无菌双蒸水共同培养。3 绘制细胞生长曲线采用细胞计数法描绘细胞生长曲线。4 形态学观察倒置相差显微镜和艇染色法从形态学上观察细胞凋亡的情况。5 n N AL a d d e r 测定提取细胞D N A ，用1 5 琼脂糖凝胶电泳进一步检测发生凋亡
5、的特征性D M 降解。6 流式细胞术分析采用流式细胞仪定量分析三组卵巢癌细胞凋亡率及细胞周期特异性和P 1 8 5 蛋白表达情况。结果：1 细胞生长曲线采用细胞计数法描绘出三组细胞生长曲线，由曲线可知经C e r b B 2 反义寡核苷酸处理的S K O V 3 细胞生长缓慢，表现出明显的生长抑制，而正义组及空白组细胞则正常生长。2 形态学观察倒置相差显微镜观察，正义组细胞生长良好，细胞透明，密度较大，呈复层性生长，细胞呈梭形，胞浆内颗粒较少，细胞核隐约可见。反义组细胞密度明显减小，细胞颗粒较多，细胞闯界限模糊，漂浮细胞数量增加，存活细胞显著减少。经H E 染色后进行光镜观察，可看到细胞形态也
6、出现了明显中文摘要改变，正义组细胞呈梭形，形态饱满，细胞核染色均匀，核仁清晰可见，而在反义组细胞中出现细胞质浓缩，变圆，核碎裂等，提示反义组细胞出现凋亡的形态学改变。3 D N AL a d d e r 测定提取反义组和正义组细胞D N A ，经1 5 琼脂糖凝胶电泳显示反义组细胞D N A 出现凋亡的特征性改变，即D N A 呈梯度样降解。正义组细胞D N A 未出现凋亡的特征性改变。进一步证明反义寡核苷酸诱导卵巢癌细胞凋亡。4 细胞凋亡率变化流式细胞仪检测表明反义组细胞2 4小时的凋亡率9 0 2 ，而正组及空白组细胞凋亡率分别为2 6 7 和2 9 8 。随时间延长，凋亡率增加，7 2
7、小时反义组细胞凋亡率达到1 5 9 2 ，正义组和空臼组细胞凋亡率则为3 9 4 和4 0 2 。反义组凋亡率与正义组及空白组相比较，差异有显著性( P 0 0 5 ) 。提示C e r b B 2 反义寡核苷酸诱导卵巢癌细胞凋亡。5 细胞周期与增殖指数变化细胞周期分析表明反义组细胞子G 0 G 1 期细胞分布率为7 3 7 7 ，而正义组及空白组为6 7 2 8 和6 6 7 2 反义组和正义组及空白组相比较，p 0 0 5 ) C e l lc y c l ea n a l y s e db yf l o wc y t o m e t r ys h o w e dt h ec e l l
8、so fA S -O D Ng r o u pi n c r e a s e di nG 0 G lp h a s ei n7 3 7 7 a n dd e c r e a s e di nb o t hSa n dG 2 Mp h a s e si n1 3 8 3 ，1 2 6 8 T h eP I ( p r o l i f e r a t i o ni n d e x ) i nA S O D N S - O D Na n dt m t r e a t e dc o n t r o lg r o u p sw a s2 6 4 8 ，3 2 8 6 a n d3 3 3 4 r e s
9、 p e c t i v e l y T h eP Ii nA S - O D Ng r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt l l a to fS O D Na n du n t r e a t e dc o n t r o lg r o u p s ( P 0 0 5 ) I t垴d i c a t e st h a tc - e r b B 2a n t i s e n s eo l i g o n u c l o t i d e si n d u c e da p o p t o s i so fo v a r i
10、a nc a n c e rc e i l sm a i n l yi nG 0 Glp h a s e 5 T h ep 1 8 5p r o t e i ne x p r e s s i o ni nA S O D N , S - O D Na n du n t r e a t e dc o n t r o lg r o u p sW a s6 2 7 8 4 2a n d8 3 7r e s p e c t i v e l ya t2 4h o u rw h i l e5 1 2 7 4 7a n d7 5 3r e s p e c t i v e l ya t7 2h o u r T
11、h e r eW a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nA S O D Ng r o u pa n dc o n t r o lg r o u p s I ti n d i c a t e st h a t5 u Md o s eo fa n t i s e n s eo l i g o n u c l e o t i d e sd i s t i n c t l yr e d u c e dt h e18 5 - k D al e v e lo ft h ec - e r b B 2g e n ep r o d u t
12、i nS K O V 3c e l l sw i t h2 4h r n ec o m p l e m e n t a r y - s e n s ea n du n t r e a t e d ，U S e da sc o n t r o l ，h a dn oe f f c c t C o n c l u s i o n s ：C - e r b b 2a n t i s e n s ep h o s p h o r o t h i o a t eo l i g o n u c l e o t i d e sc o u l dn o to n l yi n h i b i tt h ep
13、r o l i f e r a t i o na n dt h ee x p r e s s i o no ft h ep18 5p r o t e i nb u ta l s oi n d u c et h ea p o p t o s i si nS K O V 3o v a r i nc a n c e rc e l l sA n t i s e n s ee f f e c t so n7茎墨塑墨一。p18 5e x p r e s s i o na n dc a n c e rc e l lp r o l i f e r a t i o na r cs e q u e n c es
14、p e c i f i c O u rr e s u l t ss u g g e s tt h a ta n t i s e n s es t r a t e g i e sh a v et h ep o t e n t i a lo fp r o v i d i n gn e ws t r a t e g i e sf o rt h et h e r a p yo fo v a r i a nc a n c e r K e yw o r d s ：c e r b B 2 ，p18 5 ，a n t i s e n s eo l i g o n u c l e o t i d e s ，g
15、e n et h e r a p y ，o v a r i a nc a n c e l “ c e l l ，a p o p t o s i s 8研究论文O - e r b B 2 反义寡核酱酸诱导卵巢癌细胞凋亡蓠言在现有治疗手段下，卵巢癌5 年擞存率一直徘徊在2 8 3 5 I “，敌有必要寻找新的治疗方法，以进一步提糍露巢癌患者的生存时秘。遥年采，黪巢瘗基因治疗方兴未艾，特烈是在反基因治疗方露敬徭了一些明显效果 I 州。E 知C e r b B 2 ( H E R n e u ) 原癌基因的产物是分子量为1 8 5 k D a 的糖蛋舀，鞠P 1 8 5 ，怒其有酪氨酸激酶活往黪缨麓膜
16、受体，当冀与配俸缝合嚣，籀激滔缨熬痨郝酪氨酸激酶，完成传递细胞调控信号的过程。目翦大部分实验资料表明原癌基因C - e r b B 2 在约2 0 4 0 的卵巢癌巾存在基因扩增和其蛋臼产物的过度表达。有作者对卵巢癌缨臆株进行臻究，发现C - e r b B 2 过度表达者侵袭力强，恶性程度趣，说明C e r b B 2 表达与卵巢癌的生物学行为有一定关系吲。F 1 i p 等邛j 研究C - e r b B 2 的过度表达与郛巢癌预露及纯疗的关系，结架显示：晚期瓣瘤、手术鸯残余瘤及霹纯疗不敏感者，C e r b B 2 表达率毫，有统计学意义。且C e r b B 2 阳性者预后明显不良。B e r c h u c k 等l l 发现，C - e r b B 2
