细胞工程大实验

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1、1仲恺农业工程学院课程学习报告课程名称：细胞工程大实验课程名称：细胞工程大实验学期：学期：2008-20092008-2009 学年第一学期学年第一学期实验一实验一 培养基母液和培养基的配制培养基母液和培养基的配制实验二实验二 水稻及胡萝卜再生体系的建立水稻及胡萝卜再生体系的建立实验三实验三 悬浮细胞体系的建立悬浮细胞体系的建立实验四实验四 植物遗传转化植物遗传转化实验五实验五 原生质体游离与培养原生质体游离与培养实验六实验六 植物快速繁殖植物快速繁殖实验七实验七 玉米幼胚接种玉米幼胚接种院院 系：系： 生命科学学院生命科学学院 班班 级：级： 姓姓 名：名： 学学 号：号： 2实验一实验一

2、培养基母液和培养基的配制培养基母液和培养基的配制摘要摘要 为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成 分，按原量 10 倍、100 倍或 1000 倍称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做母液。这样，每 次配制培养基时，取其总量的 1/10、1/100、1/1000，加以稀释，即成培养液。各种混合 液（母液）或单独配制药品，均应放入冰箱中保存，以免变质、长霉。至于蔗糖、琼脂等， 可按配方中要求，随称随用。 关键词关键词培养基母液、培养基、无机盐、有机物、激素、附加物 前言前言 本实验的目的是要学习并掌握培养基母液配制的方法和培养基配制的方法，掌握不同 物质浓度按比列稀

3、释和转化的计算方法。 在配制培养基前，先配制单一化合物母液可以提高称量的准确性并减少多次称量的麻 烦，配制多种培养基都需要的同一种母液，放置冰箱中保存，用时按比例稀释即可。培养 基实际一是一个人工模拟的植物生长、发育环境，在植物组织培养过程中，外植体生长所 必需的营养万分生长因子、理化环境等主要同培养基提供。不同材料对培养基的要求不尽 相同，适当地设计和选用培养基，对组织培养取得成功是至关重要的。另外，组织培养物 的脱分化、分化等状态的调控，次生代谢物的产出等都要通过调节培养基成分来实现。一一 材料与方法步骤材料与方法步骤（一）试剂（一）试剂培养基母液（以 MS 为例）：NH4NO3；KNO3

4、 ；CaCl2.2H2O；MgSO4.7H2O；KH2PO4；(NH4)2SO4；H3BO3；KI；MnSO4.H2O；ZnSO4.7H2O；NaMoO4.2H2O；CuSO4.5H2O；CoCl2.6H2O；Na2EDTA.2 H2O；FeSO4. 7H2O；甘氨酸；盐酸吡哆醇；盐酸硫氨素；烟酸；肌醇；2，4D；6 BA；NAA 培养基：1N HCl ；1N KOH； 标准 pH 溶液（25下，pH4.01 和 pH6.08 的标准溶液各 100ml） ；蔗糖；琼脂；水解蛋白酶；谷氨酰胺；脯氨酸。 （二）方法步骤（二）方法步骤 1 1、培养基母液配制、培养基母液配制 (1) 大量元素母液 大

5、量元素母液含 N、P、K、Ca、Mg、S 等六种盐类的混合溶液，可配置 10 倍或 20 倍的 母液，使用时每配置 1000ml 培养基时取 100ml 或 50ml 母液。表 1 MS 培养基大量元素母液制备序号药品名称培养基浓度（mg/L）扩大 10 称量(mg)备注 1NH4NO3165016500 2KNO3190019000 3CaCl22H2O 4404400 4MgSO47H2O3703700 5KH2PO41701700蒸馏水定 容至1000ml1 将 1 升培养基所需各种微量元素扩大 10 倍，进行实际称量。分别称取上述药品： 16.5g，19g，4.4g，3.7g，1.7g

6、。32 将混合液倒入 1000ml 量筒或容量瓶中定容，转入试剂瓶中，混均，贴上标签，4 储存。 （2）微量元素母液 1 按培养基配方所列元素成分，取相应分析纯化学试剂（对水合分子不同的试剂要进 行换算） 。例如换算 MnSO44H2O：MnSO44H2O 分子质量/ MnSO47H2O 分子质量， 再乘以 11.15g。 2 将 1 升培养基所需各种微量元素扩大 1000 倍，进行实际称量。分别称取上述药品： 8.45g，4.3g，3.1g，0.425g，0.125g，0.0125g，0.0125g。 3 将混合液倒入 500ml 量筒或容量瓶中定容，转入试剂瓶中，混均，贴上标签，4储 存。

7、 表 2 MS 培养基微量元素的配制序号化合物名称培养基浓度 （mg/L）扩大 1000 倍称量(mg)备注1MnSO44H2O22.322300 2ZnSO47H2O8.68600 3H3BO36.26200 4KI0.83830 5Na2MoO42H2O0.25250 6CuSO45H2O 0.02525 7CoCl26H2O 0.02525蒸馏水定容 至 500ml（3）铁盐母液 铁盐与其他无机成分混合易产生沉淀，须单独配制。通常采用硫酸亚铁和 Na2-EDTA 混 合物，以形成络合物，提高铁盐的利用率。铁盐一般配成 100 倍的螯合铁盐母液，使用时 每配置 1000ml 培养基取 10

8、ml。 表 3 MS 铁盐母液的配制序号化合物名称培养基浓度 （mg/L）扩大 100 倍称量(mg)备注1Na2-EDTA 3.73373 2FeSO47H2O 2.78278蒸馏水定容至100ml分别称取药品：0.373g，0.278g，置于烧杯中，在沸水浴中加热搅拌 20-30min，当出现金 黄色时拿出来，调 PH 至 5.5，冷却后倒入棕色瓶保藏。 （4）有机成分母液 有机化合物母液原则上应分别单独配制，实际使用时，往往配制成除肌醇外其他有机 成分的混合液，一般配置成 100 倍或 1000 倍母液，使用时每配置 1000ml 培养基取 10ml 或 1ml。 表 3 MS 培养基有

9、机物质母液的制备序号化合物名称培养基浓度（mg/L）扩大 100 倍称量(mg)备注1甘氨酸2200 2盐酸硫胺素(VB1)0.440 3盐酸吡哆素(VB6)0.550 4烟酸0.550蒸馏水定容 至 1000ml5肌醇10010000单独配制（5）激素母液 激素母液：各种激素单独配制成母液，浓度从 0.1mg/ml 到 1.0mg/ml 不等。41 2，4D 母液（20 mg100 ml）：用万分之一天平称取 2，4-D 20 mg 用少量 95%乙 醇充分溶解 加水定容为 100 ml。 2 6BA 母液（20 mg100 ml）：用万分之一天平称取 6BA 20 mg 用少量 1N HC

10、l 充分溶解 加水定容为 100 ml。 3 NAA 母液（20mg100 ml）：用万分之一天平称取 NAA 20 mg 用少量 95%乙醇充 分溶解 加水定容为 100 ml。 2 2、培养基的配制（、培养基的配制（300ml300ml） B5B5 培养基：培养基：（大量元素、微量元素、有机、肌醇、Fe 盐）+0.5mg/L 2，4-D+7g/L 琼脂 +30g/L 蔗糖，PH=5.8 N6N6 培养基：培养基：（大量元素、微量元素、有机、肌醇、Fe 盐）+0.5mg/L 2，4-D+水解蛋白酶 500mg/L+谷氨酰胺 700mg/L+脯氨酸 700mg/L+7g/L 琼脂 +30g/L

11、 蔗糖，PH=5.8 (1) 混合培养基中的各成分（取母液）：200ml 烧杯一只，用 50ml 量筒量取大量元素 20ml（10X） ，再用移液管分别吸取微量元素 2ml（100X） ，铁盐 2ml（100X） ，有机成分 2ml（100X）肌醇 2ml（100X）和激素类（浓度临时确定） ，最后用蒸馏水定容至所需配制 的培养基体积的一半。(2) 溶化琼脂：称取应加的琼脂和蔗糖，加蒸馏水至所需配制的培养基体积的一半， 在壁上做一液面记号，放置约 0.5-1h，待蔗糖溶解，琼脂发胀后，加热烧开溶化琼脂。若 失水，则加蒸馏水至液面记号处。(3) 混合：把 1 和 2 混合在一起，搅匀。 (4)

12、pH 值：培养基的 pH 值会影响植物对养分的吸收与利用，还会影响琼脂等固化 剂量的凝固，因此培养基必须调至一定的 pH 值。用 pH 计或 pH 试纸测 pH 值，并用 1N 的 NaOH 或 HCl 调至 pH 为 5.8。不同植物培养所要求的 pH 值有所不同。此外，培养基经高压 灭菌后 pH 值一般要降低 0.10.2，所以在灭菌前调 pH 值时要相应提高。(5) 分装：用玻璃漏斗将配好的培养基分装于 10 个三角瓶中，分装时注意不要把培 养基倒在瓶口或内外壁上，以防引起污染，然后用棉塞或硫酸纸封好瓶口。写明培养基代 号，日期，实验人等，扎好线绳。 3 3、培养基的灭菌、培养基的灭菌

13、培养基必须保证绝对无菌，否则因其营养丰富，细菌、真菌极易滋生，从而导致培养 外植体死亡。本实验采用高压蒸汽灭菌法。 二二 结果讨论结果讨论微量元素是培养基不可缺少的部分。由于较难称取，所以每次实验应首先拟好实验大 纲，配置好母液，这能够使实验的进度简便快捷。实验中的培养基的配比不是绝对的，我 们应根据实际情况对其进行改变。并尝试用不同的培养基培养同一外植体，通过结果寻找 实验的改进。实验二实验二 水稻及胡萝卜再生系的建立水稻及胡萝卜再生系的建立摘要摘要 以胡萝卜块根及水稻种子为材料诱导愈伤组织，然后将愈伤组织转入分化培养基进行 培养。结果表明，在试用的培养基中以 2，4-D 浓度为 01mgL

14、 时愈伤组织状态为最 佳；愈伤组织的诱导宜在黑暗条件下；培养基种类时愈伤组织的分化率影响不大，且主要 以胚状体形式出芽。 组织培养的物的脱分化、生长及分化均是基因选择地表达和关闭地结果，作为第一信 使的植物激素在这些过程中是信号传导地发起者。因此，培养物地生长、分化方向地控制 主要是通过添加不同种类和浓度的植物激素来实现的。由外植体诱导愈伤组织是一个脱分5化的过程，通常需要加入较高比例的生长类激素，如 2，4D。 关键词关键词水稻；胡萝卜；愈伤组织；继代 前言前言 在一定的培养条件下，愈伤组织通过器官发生途径形成芽或根的分生组织，继而发 育成完整的植株，或通过体细胞胚胎发生途径形成胚状体，继而

15、发育成完整的植株。由愈 伤组织再生植株是一个再分化过程。一般而言，高比例的细胞分裂素/生长素有利于芽的形 成；低比例时有利于根的形成。再生植株移至生根培养基上可以生根，生根的小苗经过练 苗后可移栽室外培育。本实验的目的是学习利用外植体诱导形成愈伤组织的方法，了解其 诱导继继代培养的过程。 一一 材料与方法材料与方法 1.1 植物材料植物材料 胡萝卜块根 水稻种子 水稻愈伤组织 1.2 方法方法 1.2.1 愈伤组织诱导 1）外植体的消毒 胡萝卜：将胡萝卜块洗净，削皮、切除两端、切成小块，75%酒精浸泡 3 分钟，倒掉 酒精，无菌水洗 1 次，用 1%HgCl2 消毒 12 分钟，在用无菌水洗 34 次。 水稻：挑选约 100 粒饱满的水稻种子剥去外壳，将去壳的种子用 0.1%升汞消毒 12 分 钟，然后用无菌水洗 34 次 2）接种 胡萝卜愈伤组织诱导培养基为：B5(大量,微量,肌醇,铁盐)+ 2，4-D0.5mg/L+蔗糖 30g/L+琼脂粉 7g/L ，pH 5.8；B5(大量,微量,肌醇,铁盐)+ 6-BA0.2mg/l+ 2,4-D0.1mg/L+ 蔗糖 30g/L+琼脂粉 7g/L ，pH 5.8；MS(大量,微量,肌醇,铁盐)+2,4-D0.5mg/L+蔗糖 30g/L+琼脂粉 7g/L ，pH 5.8。将消毒后的胡萝