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1、实验实验 蛋白质的基本性质蛋白质的基本性质实验一实验一 蛋白质的沉淀、变性反应蛋白质的沉淀、变性反应实验二实验二 蛋白质和氨基酸的颜色反应蛋白质和氨基酸的颜色反应实验一实验一 蛋白质的沉淀、变性反应蛋白质的沉淀、变性反应一、目的和要求一、目的和要求1了解蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的原理及它们的相互关系。 2学习盐析等生物化学操作技术。二、基本原理二、基本原理蛋白质分子在水溶液中，由于其表面形成了水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒， 所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相似。但是，在一定的物理化学因素影响下，由于蛋 白质胶体颗粒的稳定条件被破坏，如失去电荷、脱水，甚至变性失去电荷、脱水，甚
2、至变性，而以固态形式从溶液中 析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应沉淀反应。这种反应可分为可逆沉淀反应和不可逆沉淀反应 两种类型。 可逆沉淀反应可逆沉淀反应蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部结构并未发生显著变化，如 果把引起沉淀的因素去除后，沉淀的蛋白质能重新溶于原来的溶剂中，并保持其原有的天 然结构和性质。利用蛋白质的盐析作用和等电点作用，以及在低温下，乙醇、丙酮短时间 对蛋白质的作用等所产生的蛋白质沉淀都属于这一类沉淀反应。 不可逆沉淀反应不可逆沉淀反应蛋白质发生沉淀时，其分子内部结构空间构象遭到破坏，蛋白质 分子由规则性的结构变为无秩序的伸展肽链，使原有的天然性质丧失，这时蛋白质已发生 变
3、性。这种变性蛋白质的沉淀已不能再溶解于原来溶剂中。 引起蛋白质变性的因素有引起蛋白质变性的因素有重金属盐、植物碱试剂、强酸、强碱、有机溶剂等化学因素， 加热、振荡、超声波、紫外线、X-射线等物理因素。它们都能因破坏了蛋白质的氢键、离 子键等次级键而使蛋白质发生不可逆沉淀反应。 天然蛋白质变性后，变性蛋白质分子互相凝聚或互相穿插缠绕在一起的现象称为蛋白蛋白 质的凝固质的凝固。凝固作用分两个阶段凝固作用分两个阶段：首先是变性，其次是失去规律性的肽链聚集缠绕在一起 而凝固或结絮。几乎所有的蛋白质都会因加热变性而凝固，变成不可逆的不溶状态。三、材料与试剂三、材料与试剂1.实验材料：实验材料：鸡蛋或鸭蛋
4、。 2实验试剂：实验试剂： (1)蛋白质溶液：蛋白质溶液：取 5mL 鸡或鸭蛋清，用蒸馏水稀释至 l00mL，搅拌均匀后用 48 层纱布过 滤，新鲜配制。(2)蛋白质氯化钠溶液蛋白质氯化钠溶液：取 20mL 蛋清，加蒸馏水 200mL 和饱和氯化钠溶液 l00mL，充分搅 匀后，以纱布滤去不溶物(加入氯化钠的目的是溶解球蛋白)。 (3)其他试剂其他试剂 硫酸铵粉末 饱和硫酸铵溶液 0.5乙酸铅溶液 10三氯乙酸溶液 浓盐酸 浓硫酸 浓硝酸 0.1%硫酸铜溶液 饱和硫酸铜溶液 0.1%乙酸溶液 10乙酸溶液 饱和氯化钠溶液 10%氢氧化钠溶液 11121395乙醇14四、实验器材四、实验器材试管
5、及试管架 小玻璃漏斗 滤纸 玻璃棒 烧杯 量筒 100恒温水浴箱五、操作方法五、操作方法1蛋白质的盐析作用蛋白质的盐析作用 用大量中性盐中性盐使蛋白质从溶液中沉淀析出的过程称为蛋白质的盐析作用盐析作用。蛋白质是亲 水胶体，蛋白质溶液在高浓度中性盐的影响下，蛋白质分子被中性盐脱去水化层，同时所 带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。析出的蛋白质仍保持其 天然性质，当降低盐的浓度时，还能溶解。因此，蛋白质的盐析作用是可逆过程盐析作用是可逆过程。 沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度不同；而沉淀相同的蛋白质，因使用中性盐类不 同所需的盐浓度也有差异。例如，向含有清蛋白和球蛋白的鸡蛋清
6、溶液中加硫酸镁或氯化 钠至饱和，则球蛋白沉淀析出；加硫酸铵至饱和，则清蛋白沉淀析出。另外，在等电点时， 清蛋白可被饱和硫酸镁或氯化钠或半饱和的硫酸铵溶液沉淀析出。所以在不同条件下，用 不同浓度的盐类可将各种蛋白质从混合溶液中分别沉淀析出，该法称为蛋白质的分级盐析蛋白质的分级盐析， 并在提纯蛋白质时常被应用。 取一支试管，加入 3mL 蛋白质氯化钠溶液和 3mL 饱和硫酸铵溶液，混匀，静置约 10min，则球蛋白沉淀析出，过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，直 至粉末不再溶解，达到饱和为止，此时析出的沉淀为清蛋白。静置，倒去上部清液，取出 部分清蛋白沉淀，加水稀释，观察它是否溶解。
7、 2重金属盐沉淀蛋白质重金属盐沉淀蛋白质 重金属盐类易与蛋白质结合成稳定的沉淀而析出。蛋白质在水溶液中是酸碱两性电解 质，在碱性溶液中(对蛋白质的等电点而言)，蛋白质分子带负电荷，能与带正电荷的金属 离子结合成蛋白质盐，当加入汞、铅、铜、银等重金属的盐时，蛋白质形成不溶性的盐类 而沉淀，并且这种蛋白质沉淀不再溶解于水中，说明它已发生了变性。 重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，因此在生化分析中，常用重金属盐除去体 液中的蛋白质；在临床上用蛋白质解除重金屑盐的食物性中毒。但应注意，使用乙酸铅或 硫酸铜沉淀蛋白质时，试剂不可加过量，否则可使沉淀出的蛋白质重新溶解。 取 3 支试管，各加入约 1m
8、l 蛋白质溶液，分别加入 0.5乙酸铅溶液 13 滴和 0.1硫 酸铜溶液 34 滴，观察沉淀的生成。向第一、二支试管再分别加入过量的乙醋铅和饱和硫 酸铜溶液，观察沉淀的再溶解。 3无机酸沉淀蛋白质无机酸沉淀蛋白质 浓无机酸(除磷酸外)都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。这种沉淀作用可能是蛋白质颗 粒脱水的结果。过量的无机酸(硝酸除外)可使沉淀出的蛋白质重新溶解。临床诊断上，常 利用硝酸沉淀蛋白质的反应，检查尿中蛋白质的存在。 取 3 支试管，分别加入浓盐酸 15 滴，浓硫酸、浓硝酸各 10 滴。小心地向 3 支试管中，沿管壁加入蛋白质溶液 6 滴，不要摇动，观察各管内两液面处有白色环状蛋白质沉淀
9、出现。 然后，摇动每个试管，蛋白质沉淀应在过量的盐酸及硫酸中溶解。在含硝酸的试管中，虽 经振荡，蛋白质沉淀也不溶解。 4有机酸沉淀蛋白质有机酸沉淀蛋白质 有机酸能沉淀蛋白质。在酸性溶液中(对蛋白质的等电点而言)，蛋白质分子带正电荷， 能与带负电荷的酸根结合。生成不溶性蛋白质盐复合物而沉淀。三氯乙酸和磺基水杨酸是 沉淀蛋白质最有效的两种有机酸。 取一支试管，加入蛋白质溶液约 0.5mL，然后滴加 10三氯乙酸溶液数滴，观察蛋白 质的沉淀。 5有机溶剂沉淀蛋白质有机溶剂沉淀蛋白质 乙醇、丙酮都是脱水剂，它能破坏蛋白质胶体颗粒的水化层，而使蛋白质沉淀。低温 时，用乙醇(或丙酮)短时间对蛋白质的作用，
10、还可保持蛋白质原有的生物活性；但用乙醇 进行较长时间的脱水可使蛋白质变性沉淀。 取一支试管，加入蛋白质氯化钠溶液 1ml 再加入 95乙醇 2ml 并混匀，观察蛋白质的 沉淀。 6加热沉淀蛋白质加热沉淀蛋白质 蛋白质可因加热变性沉淀而凝固，然而盐浓度和氢离子浓度对蛋白质加热凝固有着重 要影响。少量盐类能促进蛋白质的加热凝固；当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全、 最迅速；在酸性或碱性溶液中，蛋白质分子带有正电荷或负电荷，虽加热蛋白质也不会凝 固；若同时有足量的中性盐存在，则蛋白质可因加热而凝固。 取 5 支试管，编号，按表 2 加入有关试剂。 表 2 (单位：滴)试剂 管号蛋白质溶 液0.1乙
11、酸 溶液10乙酸 溶液饱和 NaCl 溶液10%NaOH 溶液蒸馏水110-72105-2310-5-2410-52-510-25将各管混匀，观察、记录各管现象后，放入 100恒温水浴中保温 10min注意观察、 比较管的沉淀情况。然后，将第 3，4，5 号管分别用 10NaOH 溶液或 10乙酸溶液中和， 观察并解释实验结果。 将第 3，4，5 号管继续分别加入过量的酸或碱，观察它们发生的现象。然后，用过量 的酸或碱中和第 3，5 号管，100水浴保温 10min，观察沉淀变化，检查这种沉淀是否溶 于过量的酸或碱中，并解释实验结果。思考题思考题1在蛋白质可逆沉淀反应实验中，为何要用蛋白质氯化
12、钠溶液? 2高浓度的硫酸铵对蛋白质溶解度有何影响，为什么? 3蛋白质分子中的哪些基团可以与重金属离子作用而使蛋白质沉淀? 4鸡蛋清为什么可用作铅中毒或汞中毒的解毒剂? 5蛋白质分子中的哪些基团可以与有机酸、无机酸作用而使蛋白质沉淀? 6在加热沉淀蛋白质的实验过程中应注意哪些问题?实验二实验二 蛋白质与氨基酸的颜色反应蛋白质与氨基酸的颜色反应一、实验原理一、实验原理1蛋白质和氨基酸鉴定的常用方法原理蛋白质和氨基酸鉴定的常用方法原理蛋白质所含有的某些氨基酸及其特殊结构，能够与某些试剂反应，生成有色物质，这就是蛋白质和氨基酸的颜色反应。(1)双缩脲反应：双缩脲反应：当脲(即尿素)加热至 180时，两
13、分子脲缩合，放出一分子氨形成双缩脲(biuret)，双缩脲在碱性溶液中与铜离子(Cu2+)结合生成复杂的紫红色化合物。蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应。但是含有一个-CS-NH2，-CH2-NH2，-CRH-NH2，-CH2-NH-CHNH2-CH2OH，-CHOH-CH2NH2等基团的物质，甚至过量的铵盐也干扰本反应。 、(2)Millon 反应：反应：单酚及双酚和吲哚衍生物能与 Millon 试剂(硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物)产生颜色反应。单酚衍生物(如酪氨酸)与 Millon 试剂反应呈粉红色至暗红色。双酚和吲哚衍生物，如色氨酸
14、与 Millon 试剂呈黄色至红色。这些反应最初产生的有色物质可能是酚的亚硝基衍生物，经互变异构后，成为颜色更深的邻醌肟，最终形成红色稳定产物。不能利用 Millon 反应检测尿蛋白，试剂中的汞离子能被脲、无机盐所沉淀，使试剂失效。碱也能沉淀汞离子，因此鉴定碱性试样时，须先酸化。(3)蛋白的黄色反应：蛋白的黄色反应：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸等，遇到浓硝酸可硝化成黄色物质。此化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的邻硝醌酸钠。这就是蛋白的黄色反应。皮肤、指甲和毛发等遇到浓硝酸变黄即是这个反应的结果。参考反应如下：蛋白质的苯丙氨酸不易硝化，一般不发生黄色反应，若加入少量浓硫酸
15、，则得到明显的黄色反应。(4)茚三酮反应：茚三酮反应：蛋白质、多肽和各种氨基酸具有茚三酮反应。除无 氨基脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色外，其他氨基酸生成紫红色化合物，最终变为蓝色。该反应已广泛地用于氨基酸定量测定。2特定氨基酸鉴定的方法原理特定氨基酸鉴定的方法原理(1)含酚基氨基酸含酚基氨基酸，如酪氨酸，利用上述 Millon 反应。(2)含苯环氨基酸含苯环氨基酸，如苯丙氨基和酪氨酸利用上述蛋白黄色反应。(3)含吲哚基氨基酸含吲哚基氨基酸，如色氨酸，利用 Hopkins-Cole 乙醛酸反应加以鉴定。含色氨酸蛋白质或色氨酸在浓硫酸中与乙醛酸反应形成红紫色物质。NO3-、NO2-、ClO3-以及过多的
16、Cl-干扰该反应。有微量 CuSO4或 Fe3+存在时，可以加强色氨酸的阳性反应。(4)含胍基的唯一氨基酸即精氨酸含胍基的唯一氨基酸即精氨酸，可以利用坂口(Sakaguchi)反应加以鉴定。精氨酸与 萘酸在碱性次溴酸钠(或次氯酸钠)溶液中发生反应，产生红色产物。该反应受胍乙酸、甲胍和胍基丁胺等干扰。反应方程式：由于过量次溴酸钠缓慢氧化上述有色物质， 氨基酸破裂，引起颜色消褪，必须加入浓脲溶液，破坏过量的次溴酸钠，以增加呈色反应的稳定性。(5)含巯基氨基酸含巯基氨基酸，如半胱氨酸，在碱性条件下与亚硝基铁氰化钠反应形成紫红色物质。胱氨酸经 KCN 还原成半胱氨酸后，也呈阳性反应。反应方程式：(6)含酚核或咪唑环氨基酸含酚核或咪唑环氨基酸，如酪氨酸和组氨酸，利用 Ehrlich 重氮试剂法，重氮化合物
