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1、王晓东科研思路追踪王晓东科研思路追踪无疑，王晓东已经成为中国生物学研究实力的象征。转贴者读硕士时曾经有幸现场聆听晓东博士的讲课。我想告诉大家的是，晓东博士的博士经历非常非常的一般，他的成功完全来自于他博士后所取得的成绩。我想这也是为什么原作者一开始就从晓东博士的博士后经历开始讲起的原因吧！今天看到一篇帖子，觉得对所有的研究生的弄清楚怎样做研究是非常有用的。启示：由于王晓东的研究逻辑清晰，方法简单明了，在按时间顺序阅读文献的过程中，通过预测文献的内容以及当年王晓东即将开展的工作，我得到了象看推理小说一样的乐趣。而预测之外的许多工作都让我茅塞顿开，受益匪浅。正是这些乐趣与受益支撑我花很多时间和努力
2、看完文献并写下此文。这种受益是全面的：不同 assay 的微小差别决定了纯化得到的蛋白的不同；体外重建的清晰性给我留下了很深的印象；我发现有几篇文章的内容和质量都远远超出所发表杂志的要求，而国内实验室肯定会牺牲竞争需要的时间往高分杂志投，或者将文章拆成几篇；文章文字的简洁；通过突变分辨是自剪切还是其它蛋白的剪切；体外实验应该取得体内实验的支持；为了确证最好用不同的细胞株不同的调亡刺激重复实验；对于王晓东为何在高度竞争的领域能一直处于领先，我有了自己的一些猜测；对于调亡的研究，我有了自己的一些想法正文本文是我在博士阶段写的基础综述。这篇综述花了我相当长的时间，我看了王晓东实验室所有的文章，甚至将
3、他讲课的故事和他 E-mail 给我的 essay 都揉了进来，思路是理清楚了，语言却还是晦涩的，有些甚至是卖弄的和夸张的。本来想着有时间再整理润色一下，然而交差之后一年过去了，这篇文章却仍然躺在电脑的某个角落。我相信对王晓东感兴趣的人很多，却少有人真正去研究他的文献，理解他的工作思路。尽管文字晦涩，相信感兴趣的人还是能从这篇综述中获得某些信息。物该尽其用，把它贴出来，权当献给 Biology 板的圣诞礼物吧。故事外的故事四年前，我在走进教室的时候碰到了风尘仆仆的王晓东。王穿着灰色调的衣裤，背着一个很土的绿包，身体不是很挺拔，脸宽大且棱角分明，要不是走路的时候有一些坚定，很容易被别人当作进城的
4、打工汉。他从最简单的开始讲起，科研需要三板斧，要是能掌握两板也不错渐渐地教室的气氛有点反常，好像大家都在屏息一样：他在讲他和学生刘雪松进行纯化蛋白比赛的故事及至他用漂亮的数据图将结果展现给我们的时候，我们才象听了一次武侠传奇一样如梦方醒。王循序渐进、清晰明了、讲故事般的授课方式给我留下了很深的印象。为了加深这种印象，两年之后我又和师弟师妹们一起再次听了他的课。而当时我刚好有纯化一个未知因子的打算，于是我浏览了他的实验室主页。在我粗粗翻阅了他发表的文献之后，我惊奇地发现他的重要发现基本上都是用“建立体外检测体系跟踪纯化活性”的模式进行的。我对这一模式的有效性产生了很大的兴趣。当我在博士三年级被要
5、求写综述的时候，我决定研究他的论文，把这一模式彻底搞清楚凋亡的线粒体途径王晓东的科研思路追踪关键词：调亡、程序性死亡、线粒体、caspase、王晓东摘要：凋亡的线粒体途径是生物学界阐明得最为明确的信号通路之一，是发展最为迅速的领域之一。在此领域中贡献最大的当属华人科学家王晓东。他利用经典的生化技术无可辩驳地发现并梳理了这一通路。本文通过系统研究王晓东的论文，试图追踪王晓东的科研思路，并以此为主，再现这一领域激动人心的发现历程。从博士后研究开始-技术训练与选题的由来1991-1995 年，王晓东在美国德克萨斯大学西南医学中心进行博士后训练，师从诺贝尔奖获得者 Joseph L. Goldstei
6、n 和 Michael S. Brown 教授，从事胆固醇调节基因的表达调控的研究。1993 年，王和他的同事利用 gel shift assay 跟踪纯化，从 Hela 细胞核中分离出了与低密度脂蛋白 promotor 的调控序列相结合的蛋白SREBPs1,2。这是王最早操练“体外 assay 跟踪纯化进程”的方法，王正是利用这种方法随后在凋亡领域做出了一系列令人炫目的实验。SREBPs 是膜定位蛋白，它的膜结合域被蛋白酶切除后，才能进入核内，调控低密度脂蛋白的表达。基于 SREBPs 被细胞裂解液中的蛋白酶活性切为两个片断的现象，王晓东建立了体外 assay，跟踪活性，通过不同性质的一系列
7、纯化柱，部分（partially）纯化到了这个蛋白。对蛋白的两个片断序列分析表明它与后来统一命名的Caspase 3 (cysteine-containing aspartate-spicific protease)同源 3。而之后的实验表明 Caspase 3 本身在细胞凋亡中也能够剪切 SREBPs，凋亡通路通过这种方式干扰膜蛋白的代谢，从而导致细胞膜泡状化（blebbing）4。研究的不断深入将王晓东的目光从胆固醇调节基因转向了凋亡。传奇的前奏-细胞调亡的研究背景细胞凋亡是由基因编码控制的程序化死亡。凋亡的细胞形态上发生很大的改变：胞体变小，胞浆浓缩，核染色质密度增高，细胞膜内陷形成凋亡
8、小体等。最后凋亡的细胞被巨噬细胞吞噬而消亡。细胞凋亡在胚胎发生过程负责清除多余的细胞。在当时，人们用遗传学的方法鉴定了三个控制线虫发育过程中细胞凋亡的基因：ced-9 ，ced-3 和 ced-4。基因 ced-9 编码的蛋白抑制细胞凋亡，已知它在人中对应的蛋白是bcl-2；而 ced-3 和 ced-4 编码的蛋白则促进细胞凋亡。其中 ced-3 基因编码一种富含丝氨酸的蛋白酶。1993 年，复旦毕业的华人学生袁钧英用蛋白序列分段检索的办法巧妙地找到了 ced-3 蛋白在人中的同源蛋白：它们隶属于 ICE（interleukin-1-converting enzyme）蛋白酶家族 5。其中
9、caspase 3 的序列和功能与 ced-3 最为接近。Caspase 3 特异地在天冬氨酸残基的位置剪切底物蛋白（比如前面说的 SREBPs） ，而自己本身在细胞凋亡中也在天冬氨酸的位置被剪切为两个片断。人们推断有一个 caspase 级联（cascade）放大的过程控制凋亡的发生。当时生物学界蓄势待发，很多生物学家都酝酿着回答这个问题：细胞是通过什么途径执行凋亡程序的 6。核心故事凋亡体（apoptosome）的发现1995 年王晓东完成博士后训练，组建了自己的实验室。他显然已经决定将寻找凋亡通路中的蛋白定为实验室未来的研究方向。顺着以前的研究而上，他首先想鉴定直接剪切 caspase
10、3 的蛋白酶究竟是什么。当仓鼠肝细胞组织匀浆液与 caspase 3 温育后，caspase 3 被其中的蛋白酶剪切成两个片断。追踪这个活性，他实验室纯化得到了这个蛋白，测序结果显示它也是一个 ICE 蛋白酶的成员，与人的 caspase 2 高度同源 7。仍然是“体外 assay 跟踪纯化进程”这一套，王已经掌握程咬金的“三板斧”了。王晓东意识到 caspase 3 的剪切是凋亡的一个简单的检测指标，通过它建立体外 assay，跟踪活性，可能可以找出细胞凋亡的通路。首先他想找到在体外能刺激启动凋亡的小分子。他把手头有的激酶、去磷酸酶抑制剂、核苷酸等，加入到未启动凋亡的 Hela 细胞质裂解液
11、中。非常幸运地，他筛选到 ATP 或 dATP 能够激活细胞裂解液的凋亡反应：1、caspase 3 被剪切激活，2、下游分子 PARP 和 SREBP 能被激活的caspase 3 剪切，3，当用激活的细胞质裂解液与仓鼠肝细胞的细胞核温育，细胞核的 DNA 被分解成核小体片断大小的 DNA，这是细胞凋亡的经典指标。借助于 caspase 3 被剪切和细胞核 DNA 分解这两个 assay，王对细胞质裂解液进行分级纯化，跟踪引起凋亡的活性组分。当他们过第一个纯化柱后，发现结合在柱子上的蛋白和通过柱子的蛋白只有重新混和在一起后，才能对 dATP 有凋亡反应。这表明两个组分可能分别代表一个凋亡反应
12、蛋白。通过固定一个组分跟踪另一个组分的方法，王和他的第一个学生刘雪松展开了竞赛：看谁先纯化到其中的一个蛋白。但是老革命被新兵打败了。刘雪松发现用 50（90？）硫酸铵沉淀组分后，活性成分仍然处在上清中，而此时的上清其它蛋白已经很少了，很快地，刘雪松把组分纯化到了一条带。传奇有时候是由巧合加运气造就的。这条带在 PAGE 胶上竟然是紫色的。王对它的光谱进行分析，发现它的光谱与细胞色素 C 一样，而蛋白测序的结果也确证了这个结论。王对于花这么大功夫纯化到在公司可以轻易买到的蛋白感到万分沮丧，而细胞色素 C 是线粒体电子传递链中的组分，它本不应该分布在细胞质裂解液中，另外对于线粒体在凋亡中有什么作用
13、，王是没有一点头绪。慢着！前面提到的抑制凋亡的 bcl-2 蛋白就是分布在线粒体外膜上的。当用细胞色素 C 的抗体特异地除掉细胞色素 c 后，细胞质裂解液也不对 dATP 反应。进一步地，王证明是因为破碎细胞的时候过于粗暴，线粒体在制备细胞质裂解液中被破坏了，如果加入蔗糖保护线粒体，裂解液将不再对 dATP 起凋亡反应（错误造就了发现！） 。最后，如果用凋亡分子刺激细胞，王发现细胞色素 c 的确从线粒体释放到细胞质中。这些实验无可辩驳地证明了线粒体参与了凋亡的反应 6。王晓东纯化的那个组分在过另外一个纯化柱后又分成了两个必需组分，顺理成章地，这两个组分最后被纯化并命名为 Apaf-1 和 ca
14、spase 98,9。谜底揭开了：Apaf-1 正是线虫ced-4 在人中的同源蛋白，而这些结果进一步说明细胞色素 c 在凋亡中的作用无可置疑。王将研究的注意力集中在阐述这三个蛋白的相互关系上。Apaf-1 通过 N 端的 CARD 结构域与 caspase 9 相互结合，通过 C 端的 WD 结构域与细胞色素 c 相互结合，通过 Walkers 结构域与 ATP/dATP 相互作用。因为与Apaf-1 共沉淀的多为 ADP 而非 ATP 形式，加之不能水解的 ATP 类似物 AMP-PNP 或者 ATP-s 不能导致 caspase 3 剪切，王当时推测 ATP 的水解是必需的。但是同期与其
15、他科学家合作的发现让王重新审视了这一设想：通过比较 Apaf-1 和在果蝇中的同源蛋 DARK 的序列发现，原先被认为负责 ATP/dATP 降解的两个氨基酸在 DARK 中并不保守，这提示 ATP/dATP 的降解在凋亡反应中也许并不是必须的。进一步的实验结果验证后者才是正确的：与纯度更高的 Apaf-1/caspase 9/cytochrome c 复合体结合的主要形式是 dATP 而不是 dADP；复合体在凋亡前后结合的dATP 并没有被降解为 dADP；ATP 的另外一个非降解类似物 ADPCP 同ATP 一样可以启动凋亡。通过重组表达蛋白的体外重建系统，以及后来与其它实验室合作对复合
16、体结构的研究结果，王的实验室清晰地描绘了这些蛋白在凋亡中相互作用的情景：细胞收到凋亡信号刺激后，细胞色素 c 从线粒体中释放到细胞质，它与 Apaf-1 作用增进了与 ATP/dATP 的结合，与 ATP/dATP 的结合使 Apaf-1 蛋白 CARD 结构域相互作用多聚化，形成的含有 7 轴对称的蛋白和核苷酸的复合体被命名为凋亡体。凋亡体中的 Apaf-1 结构发生改变，招募caspase 9 并导致 caspase 9 被剪切成两段，从而被激活。激活了的 caspase 9 进一步地剪切 caspase 38-12。王的以上发现在生物界扔了一颗重磅炸弹，很多科学家参与到细胞凋亡的领域中来，竞争开始变得非常激烈，而凋亡的研究也在飞速发展。乘胜追击-凋亡体上游与下游执行蛋白的发现顺流而下，capspase 3 的激活导致了细胞核 DNA 被剪切成核小体DNA 大小的片断，那么中间的执行者是什么蛋白呢？如果将激活的 caspase 3 加入 Hela 细胞裂解液并与仓鼠肝细胞核温育，细胞核内的 DNA 被剪切成片断。这说明裂解液中存在执行蛋白。通过以上的体外
