实验指导(2011版)

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1、植植物物组组织织培培养养技技术术实实验验1 1 培培养养基基母母液液的的配配制制一一、目目的的掌握培养基母液的配制方法。二二、原原理理配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养 基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱 中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。以MS培养基为例，所需配制的母液 可分为： MS大量元素母液、 MS微量元素母液、 MS铁盐母液和 MS有机化合物母液等。另外， 还要配制生长物质母液，在不同类型的培养基中使用。三三、实实验验器器具具与与药药品品电子分析天平、扭力天平、烧杯 (50mL、100mL

2、、500mL、1000mL)、量筒、 (1000mL、100mL、25mL)、容量瓶 (1000mL、500mL、100mL)，磨口试剂瓶 (500mL、1000mL)、药勺、称量纸、玻璃棒、滴管、电炉(1000W)、冰箱。 配制MS培养基所需药品按培养基的配方准备（见附表一）。植物生长调节物质有 2，4-D，NAA，6-BA等。四四、培培养养基基母母液液的的配配制制过过程程首先，按本书的附表 1，将各种母液根据各自的扩大倍数，计算出扩大后的称取量， 然后分别进行药品称取和母液配制。具体操作如下：(1)MS大量元素母液的配制按照MS培养基配方的用量扩大 20倍，将大量元素配制成 20倍的母液。

3、配制时先用量 筒量取蒸馏水大约 800mL，放人 1000mL的烧杯中，依次分别称取药品 NH4NO3 、KN03、KH2P04、MgS047H2O、CaCl22H20 ，按顺序先后倒入烧杯中，用玻璃棒搅动， 待第一种化合物溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液倒 入1 000mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至 1 000mL，然后，倒 入细口磨砂试剂瓶中，贴上 标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名，置于4冰箱保存备用。(2)MS微量元素母液的配制 将MS培养基配方中微量元素的无机盐用量分别扩大200倍，用分析天平分别依次称 取MnSO44H20、ZnSO47H20、H3

4、BO3、KI、Na2Mo042H2O、CuSO45H20 、CoCl26H20 ，并用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后容量瓶定容后，装入 1000mL的磨口试剂瓶中，贴 上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制人姓名，置于4冰箱保存备用。 (3)铁盐母液的配制在电子天平上准确称取 2.78g硫酸亚铁 (FeSO47H2O)和373g乙二胺四乙酸钠 (Na2-EDTA)，分别倒人盛 400mL蒸馏水烧杯中，微加热并不断搅拌使之全部溶解。将两种 溶液倒人同一个 1 000mL的容量瓶中，强烈搅拌 1分钟后，用蒸馏水定容至 1 000mL，并 倒入棕色磨口试剂瓶中，经室温放置一段时间令其充分反应后，贴上标签

5、，注明配制日期、 扩大倍数、配制人姓名，置于 4冰箱保存备用。如果将新配制 的铁盐母液立即放入冰箱 中，则会容易形成沉淀。(4)MS有机母液的配制将MS培养基配方中有机物用量分别扩大200倍。用电子天平依次称取：肌醇 (环己 六醇)、盐酸硫胺素 (维生素 B1)、烟酸、甘氨酸、盐酸吡哆醇 (维生素 B6)，用蒸馏水依次 溶解并定容后，装入 500mL的磨口试剂瓶中，贴上标签，注明配制日期、扩大倍数、配制 人姓名，置于 4冰箱保存备 。(5)植物生长物质母液的配制由于水剂型的植物生长物质在组织培养中既使用方便，又消毒简单，故在配制培养基前常将常用的植物生长调节物质，如2，4D、6-BA和NAA等

6、配制成 500mgL-1浓度的母 液。其配制方法如下：2，4-D母液；准确称量 2，4-D 50mg，先用 1-3ml90%酒精完全溶解后，加蒸馏水 定容；也可以加入少量碱 (如1molL-1氢氧化钾、氢氧化钠 )溶液，使之中和成为钠盐或 钾盐，在水中溶解，再加水定容至100mL，即配成浓度为 500mgL-1的母液。贴上标签， 注明名称、浓度和配制日期，放在4冰箱保存。 NAA母液的配制过程与 2，4-D相同。6-BA母液：准确称量 50mg6-BA，加入少量碱溶液 (如1molL-1氢氧化钾、氢氧化 钠)或稀盐酸（ 1molL-1盐酸）溶液使之完全溶解后，加蒸馏水定容到100mL，即配成浓

7、 度为500mgL-1的6-BA母液。转入磨口试剂瓶中，并贴上标签，注明母液名称、浓度和配 制日期，放在 4冰箱保存待用。 五五、注注意意事事项项在配制大量元素母液时，混合、溶解各种无机盐时要注意先后顺序，尽量把 Ca2+、SO42-和PO43-离子错开分别溶解。同时稀释度要大一些，并要慢慢地边混合边搅拌。六六、实实验验报报告告在实验结果一栏中 写出每种试剂的用量实实验验2 2 M MS S培培养养基基的的配配制制与与灭灭菌菌 一一、实实验验目目的的学习用母液法配制 MS培养基以及掌握培养基灭菌的方法及操作过程。 二二、原原理理组织培养所用的培养基含有植物细胞生长所必需的各类营养物质同时也是各

8、种细菌、 真菌滋生繁殖的极好场所。因此必须对培养基等进行灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进 行。 三三、实实验验用用具具和和药药品品电子天平、扭力天平、烧杯 (5OmL、100mL、500mL、l 000mL)、量筒 (1000mL、500mL、25mL)、药勺、称量纸、玻璃棒、移液管 (10mL、5mL、2mL、1mL、0.5mL、O.2mL)、电炉 (1000W)、石棉网、吸耳球、酸度计或 pH 试纸(5.0-7.0)、三角瓶 (50mL、100mL)或果酱瓶、耐高温高压的专用封口膜、线绳、冰箱、 手提式消毒灭菌锅，蔗糖、琼脂、1molL-1 HCl、1molL-1NaOH，2，4-D母液及

9、 MS基 本培养基各母液 (实验1制备)。 四四、实实验验步步骤骤(1)培养基的配制每组配培养基 1000mL，培养基组成为： MS+6-BA0.3 mgL-1十NAA0.01 mgL-1十 30gL-1蔗糖十 4gL-1琼脂(pH 6.0)。首先，将所需的各贮存母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿，如量筒、烧杯、 移液管、玻璃棒、漏斗等放在指定的位置；准备好蒸馏水及做瓶盖用的专用封口塑料薄膜 或用于封口的棉塞、牛皮纸和包装线等。然后，根据所需配制的培养基用量，计算需吸取 各母液的数量 (mL)。取50mL的烧杯一只，用 25mL量筒取大量元素母液 25mL，然后，用各母液专用移液 管分别吸取

10、微量元素母液 0.5ml、有机母液 5mL、铁盐母液 5mL和及相应量的 6-BA和NAA， 置于烧杯中备用 (注意：各母液移液管不能混用 )。 取500mL烧杯一只，先用量筒量取 500mL蒸馏水倒入烧杯中，用记号笔画好液位线， 再将蒸馏水倒出一半。准确称取琼脂粉2.5g倒入烧杯中，再称蔗糖 15g备用。将加入琼 脂的烧杯置于电炉上或微波炉内煮沸，待琼脂完全溶化后，加入15g蔗糖，充分溶解后， 将准备好的含大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素的母液混合液倒人烧杯中，用蒸 馏水将装过母液混合液的烧杯洗三遍，一并倒人500mL烧杯中，加热至沸腾后，将烧杯端 离火源，并加蒸馏水定容至设定的液位线

11、。 用1molL-1HCI或1molL-1NaOH将培养基的 pH值调至 5.86.0， 用酸、碱调节 pH值时，应用玻璃棒不断搅拌后，再用pH试纸或 pH计测试培养基的 pH值。将500mL培养基分装入若干只 100mL大小的三角瓶中，每瓶约装 30mL培养基。分装 培养基时，切勿将培养基倒在瓶口或瓶外壁上。堵养基分装完后，应随即用专用的耐高温 高压的封口塑料薄膜或铝箔封好瓶口，并贴上标签，用记号笔注明培养基名称、配制者姓 名和配制日期，待灭菌用。(2)培养基的灭菌可用于培养基灭菌的器具有多种类型，本实验学习用手提式消毒灭菌锅进行灭菌。其 操作步骤如下：把分装好的培养基及其他需灭菌的各种用具

12、(如用牛皮纸包扎好的剪刀、镊子、解 剖刀、培养皿 )和蒸馏水等，放入消毒灭菌锅的消毒桶内，将外层锅内加入适量的水，以水 位与锅内三角搁架相平行为宜。注意加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。 然后盖上锅盖，并将盖上的排气软管插入消毒桶壁的排气槽内后，上好螺丝，逐个拧紧后， 接通电源加热。当灭菌锅盖上的压力表指针移至 0.05MPa时，打开放气阀门排除锅内冷空气，待压 力表指针回复到零位后，关闭放气阀门继续加热。当灭菌锅的压力表指针移至 0.1MPa(121.5)时，通过调节放气阀，控制热源，使压力表保持在该压力15-20min， 即可达到灭菌目的。灭菌所需时间到后，应先切断电源，让灭菌

13、锅内温度自然下降；待灭菌锅压力表的 压力降低至 “0”时，才能打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。刚灭过菌的培养基应在室温下放置2-3d后，观察有无菌类生长，以确定培养基是 否彻底灭菌。经检查没有杂菌生长污染，方可使用。 五五、注注童童事事项项（1)灭菌锅内冷空气必须排尽，否则，压力表指针虽达到了一定压力，但由于锅内冷 空气的存在并达不到对应的温度，从而影响灭菌效果。 (2)在灭菌过程中，当压力达到时，要严格控制时间，时间太长会使培养基中的一些 化学物质遭到破坏，影响培养基的成分；而时间太短则达不到灭菌效果。 六六、实实验验报报告告在实验结果一栏中写明每种试剂（母液）的取用量。

14、实实验验3 3 无无菌菌材材料料 的的转转接接和和 培培养养一一、目目的的 通过实验，掌握无菌 苗的转接和 增殖 二二、原原理理 外植体经消毒灭菌后，在无菌条件下，剥去外围幼叶，将带有23个叶原基的茎尖切 下接种到诱导培养基上，诱导芽的生长和分化，长成几个或几十个丛芽状的试管苗。试管 苗的形成主要与培养基中细胞分裂素与生长素的种类及浓度配比有关。将诱导培养基上 得到的 丛芽，切割下来进行继代培养，使每个芽又形成一个 丛芽。该过程可反复进行， 这样在短时间内可得到大量的芽。 三三、实实验验材材料料、试试剂剂及及器器具具 （1）材料 无菌苗 。 (2)试剂 酒精 (3)培养基 MS+6-BA0.3

15、 mgL-1十NAA0.01 mgL-1十30gL-1蔗糖十 4gL-1琼脂(pH 6.0) (4)器具 酒精灯、棉花塞或牛皮纸、长剪刀，解剖刀，长镊子、接种针(弯成钩形 )、接种室或超 净工作台 四四、实实验验步步骤骤（1）选幼嫩的植物茎段或叶片，用自来水冲洗干净后，先用70%酒精擦洗表面或浸泡 0.5min，再用 0.1HgCl2浸泡15min或用6%次氯酸钠浸泡 20min，转入超净工作台上，用 无菌水冲洗 35次，并用无菌吸水纸吸干，置于无菌培养皿中 ，用解剖刀将茎切成 0.51cm切段，叶片切成 0.51cm2小块，接种于诱导培养基表面，置于相应的培养条件 下进行培养。等芽增值到一定

16、数量后，可及时转接，使之数量增加或生根（转接到生根 培养基中） 。 （2）观察记录结果 每周观察一次 。观察记录的结果包括：是否污染，苗的长势 五五、注注意意事事项项 （1）在植物材料表面消毒时，应根据材料的老嫩和所用消毒剂的种类、浓度等来确定消毒 时间。时间过短，消毒不彻底，易污染；时间过长，易杀死外植体。 （2）在整个接种过程中，均需注意无菌操作，避免污染。实实验验4 4 外外植植体体的的消消毒毒及及其其愈愈伤伤组组织织的的诱诱导导一一、目目的的 通过实验，初步掌握外植体植物材料消毒、接种的无菌操作技术以及外植体愈伤组织诱 导的方法。 二二、原原理理植物组织培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官或组织，甚至单个 细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适 的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料去进行组织培养，这是取得组织培 养成功的最基本的前