高纯度低聚果糖生产技术的探讨

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1、 高纯度低聚果糖生产技术的探讨高纯度低聚果糖生产技术的探讨摘要摘要:低聚果糖是一种功能性低聚糖低聚果糖是一种功能性低聚糖,用于特殊目的的低聚果糖必须具有很高的用于特殊目的的低聚果糖必须具有很高的 纯度。本文探讨了高纯度低聚果糖的生产技术。纯度。本文探讨了高纯度低聚果糖的生产技术。 关键词关键词:低聚果糖低聚果糖 果糖转移酶果糖转移酶 呋喃果糖苷酶呋喃果糖苷酶 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶 0 前言前言 低聚果糖( Fructo2oligosaccharide、FOS) 是指在蔗糖分子的果糖残基上以-(1 -2)-2糖 苷键连接13 个果糖分子而形成的蔗果三糖(12Kest

2、ose , GF2 ) 、蔗果四糖(Nystose , GF3 ) 、蔗果五糖( 1F2fructofuranosyl nystose ,GF4) 及其混合物。 低聚果糖具有独特的生理功能(如双歧杆菌增殖因子作用、低热值、防龋齿 等) 、优良的物化性质及良好的食品加工特性,受到学者的重视。80 年代日本对 低聚果糖的代谢、组成、应用和工业化生产做了多方面的研究。1984 年,日本 明治制果株式会社用固定化增殖细胞实现了低聚果糖的工业化生产,推出了两种 名为“明治低聚G(Neosugar G) ”和“明治低聚P(Neosugar P) ”的低聚果糖产品, 表1 显示两种产品的组成:表表1 两种产

3、品的组成两种产品的组成( % ,干基干基)产产 品品 G+ F GF GF2 GF3 GF4 GF24 4明治低聚明治低聚G 33 12 25 25 5 55明治低聚明治低聚P 5 35 50 10 95 注注: G:葡萄糖葡萄糖; F :果糖果糖; GF :蔗糖蔗糖; GF2 :蔗果三糖蔗果三糖; GF3 :蔗果四糖蔗果四糖; GF4 :蔗果五糖蔗果五糖; GF2 4 : GF2 + GF3 + GF4低聚果糖的生产主要涉及两种酶:果糖转移酶和具有高果糖转移活性的呋喃 果糖苷酶。进入90 年代以来,国内外学者对低聚果糖的生产工艺条件作了大量 的 研究工作,取得了可喜的进展。用单一的果糖转移酶

4、或呋喃果糖苷酶作用于蔗糖 生产低聚果糖(单酶法) ,即使在最优条件下,由于副产物葡萄糖对呋喃果糖苷酶的 抑制作用,蔗糖不可能完全转化,所以产物中低聚果糖的含量一般在50 %60 % , 还含有30 %左右的葡萄糖和10 %左右的蔗糖。为了特殊的目的如供糖尿病患者 食用必须使用高纯度的低聚果糖如明治低聚P。目前获得高纯度低聚果糖的方法 有两种:一是用单酶法制得含50 %60 %低聚果糖的糖浆,然后用适当的方法去 除其中的葡萄糖而得到高纯度的低聚果糖,可称为两步法;一是使用双酶法或混合 酶系在蔗糖转化反应过程中同时消除葡萄糖的抑制作用使蔗糖充分转化,同时葡 萄糖转化为其他较易除去的形式,再经过简单

5、的分离纯化得到高纯度的低聚果糖, 可称为一步法。其中两步法生产高纯度低聚果糖的成本高,资料显示明治低聚的 价格是明治低聚的218 倍。一步法还处于探索中, 但是探索新的生产工艺、提高酶反应过程中蔗糖的转化 率和低聚果糖的含量生产高含量的低聚果糖在经济性 上可能是有益的。 本文结合作者的部分研究工作及国内外学者已经 进行的高纯度低聚果糖的生产技术研究情况对高纯度 低聚果糖的可行生产工艺作一探讨。 1 低聚果糖的生物合成机制低聚果糖的生物合成机制 Jong Won Yun综述了不同来源的呋喃果糖苷酶或果糖转移酶催化蔗糖转化为低聚果糖的机制。不同来源的酶的催化作用机制不同,概括起来大多数微生物果糖

6、转移酶的催化作用分两步进行:第一步形成酶-果糖复合物,释出葡萄糖;第二步该 复合物将果糖转移给水或蔗糖生成果糖或三糖。低聚果糖的生物合成机制可表 示如下:GF + Enz FEnz + G (1) F-Enz + H2OF + Enz (2) F-Enz + GFn - 1 GFn + Enz (3)(n=2，3，4）其中Enz :呋喃果糖苷酶或果糖转移酶; GF :蔗糖; F-Enz :果糖-酶复合物; G:葡萄糖; F :果糖; GFn :低聚果糖。在低聚果糖的生物合成两步反应中,第一步为快速可逆反应,第二步为不可逆 反应,蔗糖既是果糖基的供体又是果糖基的受体。在反应(1) 中,蔗糖在酶的

7、作用 下分解成果糖基的葡萄糖,该反应为必须步骤,故酶反应产物中葡萄糖的存在是不 可避免的;另外研究者发现葡萄糖抑制酶的果糖转移活性,0.9%5.4%（W/V） 的 葡萄糖即抑制黑曲霉ACTT 20611 呋喃果糖苷酶的果糖转移反应, Ki = 0.12mol/ L,所以蔗糖不能完全转化。为了提高蔗糖的转化率和产物中低聚果糖的含量就 必须设法消除副产物葡萄糖的抑制作用,这是一步法高纯度低聚果糖生产技术的 关键。在两步反应中可以看出,蔗糖(n = 2) 浓度较低时将主要发生反应(2) ,总的 结果是蔗糖水解为葡萄糖和果糖,所以为了提高酶反应产物中低聚果糖的浓度就 必须提高蔗糖浓度以抑制反应(2)

8、的发生。 2 酶源选择和产酶工艺条件优化酶源选择和产酶工艺条件优化 一个好的酶源是生产低聚果糖的保证,对产酶发酵工艺条件进行优化是使酶 源的产酶能力得到最大程度的发挥,从而得到大量而廉价的呋喃果糖苷酶或果糖 转移酶。 2.1 酶源的选择酶源的选择 一个好的酶源应具有以下几个特征:(1) 高的果糖转移活性； (2) 果糖转移 活性与蔗糖水解活性之比(即Ut/ Uh) 大；(3) 区域专一性高,如图1 只生成1-蔗 果三糖(1-kestose) ; (4) 产酶能力大。图图1 酶的专一性示意图酶的专一性示意图 许多植物、酵母、霉菌等均能产生呋喃果糖苷酶或果糖转移酶,但植物产生 的酶的活性低且产量受

9、季节的限制;而酵母转化酶水解活性较强不利于低聚果糖 的积累,故工业生产中使用的产酶菌多为霉菌,如黑曲霉ACTT 20611 、臭曲霉 NRRL 4337、日本曲霉TIT-KJ1等。作者等从土壤中分离出一株具有高果糖转移 活性的菌株黑曲霉ECBT-3 ,测定条件下比酶活达0.450U/ mg 湿细胞,Ut/ Uh 达 14.2 ,具有严格的区域专一性只生成1-蔗果三糖系产物。 2.22.2 产酶工艺条件优化产酶工艺条件优化 对产酶工艺进行优化的目的在于使产酶菌的产酶能力得到最大程度的发挥, 影响酶产率的因素主要有培养时间、碳源浓度、氮源浓度和无机盐浓度等。 2.2.1 培养时间 黑曲霉ECBT-

10、3 在摇床培养条件下,间隔24h 取样测定发酵 液中细胞密度、胞内酶活等,结果如图2 。最佳培养时间为72h , 与黑曲霉ACTT20611及黑曲霉AS-0023相同。 2.2.2 碳源浓度 呋喃果糖苷酶是诱导酶,培养基中初始蔗糖的浓度对酶产率 有较大的影响;另一方面,蔗糖浓度过高会抑制菌体的生长,图3 显示蔗糖浓度对 酶产率的影响。蔗糖最佳浓度为15 %20 %。蔗糖浓度太高、渗透压太大不利 于菌体生长。Wen Changchen 报道了相似的结果 。 2.2.3 无机盐 作者发现添加K2HPO4 及MgSO47H2O 对黑曲霉ECBT - 3 的酶产率无明显影响, 与S.Hayashi 等

11、的结果不同。添加适量硝酸钠可以明显提 高酶产率。图图2 培养时间对酶产率的影响培养时间对酶产率的影响图图3 蔗糖浓度对酶产率的影响蔗糖浓度对酶产率的影响 3 两步法生产高纯度低聚果糖两步法生产高纯度低聚果糖 3.1 低聚果糖的生成低聚果糖的生成 在50 %60 %的蔗糖溶液中加入25U/ g 蔗糖的呋喃果糖苷酶或果糖转移 酶,用缓冲溶液调节pH5.06.0 ,保温5060 ,反应2024h 即制得含50 %60 %的低聚果糖,为了重复利用酶一般采用固定化酶( IE) 或固定化细胞( IC) (或菌 丝体( IM) ) ,而让高浓度的蔗糖溶液以一定流速流过固定化酶柱或填充床式反应 器,表2 显示

12、近年来开发的低聚果糖生产工艺。 3.2 两步法生产高纯度低聚果糖两步法生产高纯度低聚果糖表表2 近年来开发的低聚果糖生产工艺近年来开发的低聚果糖生产工艺酶酶 源源 底物底物 操作方式操作方式 FOSFOSS S含量（含量（% %） 操作稳定性操作稳定性 黑曲霉黑曲霉 500g/L500g/L蔗糖蔗糖 分批分批- -连续（连续（ICIC） 50%-55%50%-55% 30d30d 屈芽短梗菌屈芽短梗菌 600g/L600g/L蔗糖蔗糖 连续（连续（IEIE） 55%55% 30d30d 日本曲霉日本曲霉 250g/L250g/L蔗糖蔗糖 外循环分批（外循环分批（IMIM） 55%55% 35d

13、35d 屈芽短梗菌屈芽短梗菌 770g/L770g/L蔗糖蔗糖 分批（分批（ICIC） 55%55% 6060批批 黑曲霉黑曲霉 300g/L300g/L蔗糖蔗糖 分批（分批（IMIM） 55%55% - 曲曲 霉霉 500g/L500g/L蔗糖蔗糖 分批（分批（IEIE） 61%61% - 日本曲霉日本曲霉 650g/L650g/L蔗糖蔗糖 分批（分批（IMIM） 61.28%61.28% 2323批批 如表2 所示,由于副产物葡萄糖的抑制作用,产物中低聚果糖的含量仅为 5060 %。要提高低聚果糖的含量,可以对上述50 %60 %的低聚果糖进行分离 纯化去除其中的单糖(葡萄糖和果糖) ,方

14、法是用碳柱层析或碳柱层析和制备性 HPLC 串联,可得到95 %的低聚果糖。但几种使用市售离子交换树脂柱层析分离 过程的回收率都很低而不适于大生产。 另一种两步法生产高纯度低聚果糖的工艺是用葡萄糖氧化酶( GOD) (或葡 萄糖氧化酶和过氧化氢酶(CAT) 协同作用) 将单酶法制得的低聚果糖糖浆中的 葡萄糖转化为葡萄糖酸,然后用离子交换法将葡萄糖酸分离除去,可得87 %左右的 低聚果糖。该法的工艺过程是:由单酶法得到的50 %60 %低聚果糖沸水浴灭酶 5min ,调节总糖浓度至20 %(w/ v) ,加入GOD , GOD 用量为50U/ g 总糖,水浴保 持温度35 ,反应过程中连续搅拌,通气,并滴加1mol/ LNaOH 溶液中和释放出的 葡萄糖酸以使pH 保持5.0 左右,反应20h 后,加热灭酶活。或调节总糖浓度为30 %(w/ v) ,按50U/ g 总糖和725U/ g 总糖的比例加入GOD 和CAT ,水浴保温30 , 搅拌并通